[54일차] single cell RNA-seq을 활용한 장내미생물과 숙주 면역계 간 상호작용 분석 동향

 

안녕하세요, 이번 글에서는 단일세포 RNA 시퀀싱(single cell RNA-seq)을 활용해 장내 미생물과 숙주 면역계 간의 상호작용 분석을 진행한 사례들과 본 상호작용 분석을 위해 개발된 몇 가지 주요 툴들을 간단히 소개하고자 합니다.

 

 

 

 

참고로, 이전 글에서는 '장내 미생물과 숙주 면역계 간의 상호작용'에 대한 배경 설명, 그리고 장내 미생물과 여러 질병들 간의 관계들을 다루어보았습니다.

 

 

[48일차] 개요, 장내 미생물과 숙주 면역계 간의 상호작용에 대하여 (+ 항생제의 위험성)

 

 

[53일차] 뇌질환과 장내미생물 : 알츠하이머병, SCRD, MGBA (microbiota-gut-brain axis)

 

 

최근 단일 세포 수준에서 유전자 발현 수준을 예측할 수 있는 scRNA-seq 기술의 등장으로 특정 세포 유형(혹은 아형)이 장내 미생물에 반응하는 양상을 관찰할 수 있게 되었습니다. 예로, 한 연구1)에서는 무균(GF, germ free) 생쥐들과 장내미생물이 존재하는(SPF, specific pathogen free) 생쥐들에서 추출한 결장(colonic) Treg 세포 유형의 유전자 발현 패턴 차이를 scRNA-seq을 통해 분석하였습니다. 그 결과, 장내 미생물 존재 유무에 따라 Treg 세포의 활성화 경로에 차이가 나타남을 확인했습니다. 구체적으로, SPF 생쥐에서 GF 생쥐에 비해 Treg 세포의 항염증 기능이 높은 활성화 경로가 두드러지게 나타났다1)고 합니다. 다시말해, 장내 미생물이 항염증 기능을 하는 조절T세포인 Treg 세포의 분화는 물론, Treg 세포의 기능(활성화 경로)에도 영향을 미칠 수 있음이 본 연구를 통해 입증되었다고 볼 수 있겠습니다.

 

2020년 연구2)에서는 GF 생쥐와 SPF 생쥐의 대장 대식세포의 유전자 발현 패턴 차이를 scRNA-seq으로 비교 분석하였습니다. 그 결과, 미생물 존재 시에만 나타나는 특정 대식세포 아형 2종을 발견했다고 합니다. 본 논문은 챗GPT 딥리서치에서 찾아준 논문이었는데요. 딥리서치는 본 연구에 의의에 대해 다음과 같이 설명합니다. 

 

해당 대식세포 아형들은 공통 전구세포(CCR2+)로부터 분화된 것으로, 무균상태에서는 그 비율이 극감하였으며 미생물에 노출되어야 정상적으로 분화 및 축적되는 세포들이었습니다. 이러한 연구는 단일세포 분석이 없었다면 식별하기 어려웠던 미생물-의존적 세포 유형을 밝힘으로써 장내미생물이 숙주의 면역세포 분화를 세포 아형 수준에서 조절함을 처음으로 명확히 보여주었습니다. 이처럼 최신 scRNA-seq 기술은 장내 면역세포, 상피세포, 신경세포 등 다양한 세포들의 미생물 반응 양상을 개별적으로 포착하는 데 활용되고 있습니다. 

 

참고로 장 조직 내 면역세포의 분화 및 활성화 경로 규명은 Monocle3, Slingshot 등의 pseudotime 분석 도구를 통해 가능합니다.

 

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여기서 pseudotime은 세포가 잠재적 생물학적 변화에 따라 이동하는 과정을 나타낸 유사시간 축을 의미하는데요. 본 축을 기준으로 해당 세포 유형이 생물학적 변화 과정(ex. 분화)에서 어느 지점에 위치하는지 추론할 수 있습니다. 이와 같은 분석을 '세포 궤적 추론(trajectory inference)'이라고 합니다. trajectory inference에 대한 보다 자세한 설명은 아래 글을 참고하시길 바랍니다.

 

 

11 Trajectory inference | Analysis of single cell RNA-seq data

 

 

T세포, 대식세포 뿐만 아니라 B세포 또한 장내미생물로부터 영향을 받을 수 있습니다. 2020년 연구3)에서는 단일세포 전사체 및 BCR 분석으로 공생미생물이 IgA 분비형 형질세포(plasma cell)의 다양성과 밀도를 증폭시켜 장내 병원균에 대한 항체 방어를 강화한다고 밝혔습니다.

 

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참고로, IgA는 위의 그림에서 보듯 두 항체의 불변 부위(constant region)가 붙어 있어 병원균을 무력화할 수 있는 집게발이 4개(두 개의 항체의 constant region이 붙어 있는 형태)인 항체입니다. 이러한 IgA는 파이어판에 있는 B세포로부터 분비된 후 상피세포벽을 transcyotsis로 통과해 장 점막층으로 이동하고, 그곳에 있는 병원균들을 무력화합니다. 그러면서도 IgA는 다른 항체와 달리 보체계를 활성화하지 않고, 염증도 유발하지 않습니다. 결국 이러한 항체를 분비하도록 유도하는 공생균은 병원균의 체내 침입을 방지하면서도 과도한 염증 반응이 이루어지지 않도록 도움을 줄 수 있기에, 장 점막 면역 균형에 있어 장내 공생균의 다양성 및 균형 유지가 중요하다고 볼 수 있겠습니다.

 

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종합해보면, T세포, 대식세포, B세포 등 다양한 면역세포 유형들이 장내미생물로부터 분화 및 활성 측면에서 다양한 영향을 받을 수 있습니다. 그리고 이러한 면역세포들은 그들끼리도 서로 상호작용합니다. 예로, 조력T세포는 대식세포 혹은 B세포의 활성을 돕습니다. 따라서 장내 미생물의 존재 유무에 따라 개별적인 면역세포의 활성 및 분화 방향성이 어떻게 달라지는지 파악하는 것을 넘어 장내 미생물의 존재 유무에 따라 면역세포 간의 상호작용 양상이 어떻게 달라지는지도 파악하는 것이 심도 깊은 장내미생물과 면역계 간의 상호작용 메커니즘 규명을 위해 중요할 듯 합니다. 보통 세포 간 상호작용은 리간드-수용체 상호작용을 예측함으로써 파악하는데요. 이를 위해 CellPhoneDB, CellChat 등의 도구가 활용되곤 합니다.

 

 

CellphoneDB - Home

 

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장내미생물은 면역계 외에도 신경계와도 상호작용할 수 있습니다. 대표적으로 '미세아교세포(microglia)'가 장내미생물에 의해 발달이 조절된다고 알려져 있는데요. 2023년에 발표된 연구4)에서는 scRNA-seq을 통해 GF(균 X) 생쥐와 SPF(균 O) 생쥐의 해마 조직 세포의 유전자 발현 패턴을 분석한 결과, SPF 대비 GF 생쥐에서 미세아교세포의 유전자 발현양상이 크게 달라짐을 확인했다고 합니다. 구체적으로, SPF 생쥐에 비해 GF 생쥐의 미세아교세포(microglia)에서 미숙한 분화 양상이 나타났으며, 그 생쥐에 다시 미생물을 이식해주자 전사체 프로파일이 정상화되었다4)고 합니다. 이는 장내미생물이 뇌의 면역세포 성숙에 필수 신호를 제공함을 단일세포 수준에서 입증한 연구로 볼 수 있겠습니다. 아래 영상에서도 장내 미생물의 불균형(dysbiosis)으로 인한 전신염증반응(systemic inflammation)이 뇌 발달에 주요 역할을 하는 microglia의 성숙 및 활성에 문제를 일으켜 자폐(autism)와 같은 뇌질환으로 이어질 수 있음을 설명하고 있습니다.

 

 

 

또한, 동물 모델을 활용한 연구에서 장내 미생물이 microglia의 기능 및 활성을 조정함으로써 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 발병을 유도할 수 있음5)을 확인하기도 했습니다. 물론, 동물 모델은 사람과 차이가 있을 수 있습니다. 그러면서도 사람을 대상으로 연구를 진행하는데에는 큰 제약이 있습니다. 이때 전에 말했듯 사람 장기를 모사한 뇌 오가노이드 기술을 활용할 수 있을 것입니다. 물론, 뇌 자체가 워낙 복잡한 만큼 그 기능을 모사하기엔 쉽지 않을 듯한데, 그래도 아래 기사와 같이 뇌 오가노이드 개발에 있어서도 진전이 이루어지고 있는 상황입니다. 그만큼 앞으로 머지 않은 미래에 알츠하이머병 연구에 뇌 오가노이드 기술을 적용할 수 있지 않을까 싶습니다.

 

 

[사이언스샷] 시험관 속 미니 뇌가 ‘아얏’…피부에서 뇌까지 통증 전달

 

 

이외에도 scRNA-seq 분석을 통해 장내미생물에서 유래한 분자(Ex. 대사산물)들이 어떤 숙주 세포의 어떤 유전자 발현에 어느정도 영향을 미치는지도 파악할 수 있습니다. 예로, 2018년 연구에서는 scRNA-seq을 통해 장내미생물에서 유래한 SCFA가 Th1 cell에서 IL-10 등의 항염증성 사이토카인의 발현을 높여 항염증 환경을 조성함6)을 밝히기도 했습니다. 그만큼 특정 미생물-숙주 세포 상호작용에 있어 미생물 유래 대사산물(metabolites)의 작용을 이해하는 것도 중요하다고 볼 수 있겠습니다. 이렇듯 현재 scRNA-seq을 활용해 장내미생물과 그 대사산물이 숙주의 면역계, 신경계, 대사 조절에 미치는 영향을 세포별로 정밀하게 밝혀내려는 시도들이 이루어지고 있는데요. 이는 대부분 장내 미생물 불균형과 질병과의 연관성(보다 나아가선 인과성)을 규명하기 위함이라고 볼 수 있겠습니다.

 

지난 글들에서도 설명했듯 장내 미생물 불균형은 염증성 장질환(IBD) 뿐만 아니라 당뇨병, 암, 자가면역질환, 뇌질환 등 정말 다양한 질병의 발병 및 중증도 악화에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 scRNA-seq을 활용해 질병과 장내미생물 간의 관계를 밝히고자 하는 노력들이 다양한 질병을 대상으로 전세계 곳곳에서 이루어지고 있습니다. 한 예로, 대장염 환자 조직(tissue)을 대상으로 scRNA-seq 분석을 진행한 연구에서는 건강인과 비교하여 대장염 환자에게서 특이적으로 나타나는 새로운 염증 관련 세포 아형(ex. inflammatory fibroblast, 괴사성 운반체 대식세포)들을 다수 찾아 냈으며, 이러한 세포아형들이 주로 활성 염증부위에 국한되어 존재하는 것은 물론 장내 유익균 감소 및 유해균 증식과 상관관계를 보였다7)고 합니다. 이는 대장염 조건에서 유해균의 증식으로 염증반응이 나타난 특정 장 조직 영역에서 면역세포들이 특이적인 활성 및 분화 프로세스를 겪게 될 수 있음을 시사한다고 볼 수 있겠습니다.

 

그러나 숙주의 장내 미생물 조성을 안다고 해서, 그로부터 숙주가 어떤 영향을 받고 있는지 정확하게 예측하는 건 어려울 수 있습니다. 장내미생물의 기능은 맥락(context)에 따라 달라질 수 있고, 무엇보다 수많은 장내미생물들이 숙주(장 점막, 면역세포, 상피세포 등), 그리고 그들끼리도 상호작용하는 장 환경에서 개별 미생물들의 종류를 안다고 해서 그들이 어떤 기능을 하고 있는지 예측하는건 애초에 무리가 있기 때문입니다. 마치, 대한민국에 어떤 사람들이 사는지 안다고 해서 그들이 대한민국을 어떻게 만들어나가고, 사회에 어떤 영향을 미치고 있을지 예측하기 어려운 것처럼 말이죠*. 그래도 결국 문제가 되는 것은 질병 발병 및 악화에 영향을 미치는 장내 미생물 다양성 감소나 유익균 감소 및 유해균 증식을 특징으로 하는 '장내 미생물 불균형(dysbiosis)'입니다. 따라서 장내 미생물 불균형으로부터 숙주가 영향을 받게 되는 '공통 메커니즘'을 규명하고, 그 공통 메커니즘을 공략함으로써 dybiosis에 의해 발생하거나 악화되는 다양항 질병들을 예방하고 치료하는 전략을 수립할 수 있지 않을까 싶습니다. 즉, 어떤 패턴의 장내 미생물 불균형이 어떤 세포의 어떤 유전자 발현 패턴에 영향을 미치는지 파악함으로써 해당 세포를 제거하거나 기능을 조정하는 그런 질병 예방 및 치료 전략을 수립할 수 있을 것이라고 생각합니다. 그리고 이러한 메커니즘은 결국 '장내미생물과 면역계 간의 상호작용'에 대한 깊이 있는 이해를 통해 밝혀질 수 있을 것으로 판단합니다. 

 

* 사실  대한민국에 어떤 사람들이 사는지 안다는 전제부터 불가능하죠. 미생물은 그나마 행동 패턴이 단순하여 그 미생물의 종 명만 알아도 그 미생물이 어떤 행동을 할지 예측할 수 있지만, 사람은 같은 국적의 사람이더라도 서로 너무 다르고, 그 사람에 대한 정보 몇개만 가지고 그 사람이 어떤 행동을 예측할지 알 수 없기 때문입니다(물론 미래에는 AI 기술의 발전으로 그 사람에 대한 정보만으로도 그 사람의 복잡한 행동 패턴까지 예측할 수 있을지 모릅니다).

 

 

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질환 중에서는 미생물에 의해 발병하게 되는 질환도 있습니다. 사람에게서 균 감염으로 인해 발병할 수 있는 대표적인 질환은 바로 '위암(stomach cancer)'입니다. 구체적으로, 헬리코박터균 감염 환자는 일반인보다 위암에 걸릴 위험도가 3~6배 높다8)고 알려져 있습니다. 이러한 사실을 토대로 진행된 한 연구9)에서는 헬리코박터균에 감염된 위암 환자, 헬리코박터균에 감염되지 않은 위암 환자, 건강한 사람(healthy controls)을 대상으로 단일세포 전사체 분석을 진행했습니다. 그 결과, 헬리코박터균에 감염된 위암 환자에서 그렇지 않은 사람(헬리코박터균에 감염되지 않은 위암 환자, 건강한 사람)에 비해 종양 침윤 T세포의 exhaustion(탈진) 특성이 뚜렷하게 나타났다9)고 합니다. 이는 헬리코박터균에 감염된 위암 환자에서 면역관문억제제 치료의 효과가 적을 수 있음을 시사합니다. 이렇듯 '미생물과 숙주 면역 간 상호작용'에 대한 이해는 미생물 감염 시에 숙주의 어떤 면역세포에서 어떤 특성이 나타나는지, 그로부터 면역 치료제의 효험이 어떻게 달라지는지에 대한 이해로 이어져 환자 맞춤화된 치료전략을 수립하는데에 도움을 줄 수 있을 것이라고 생각합니다.

 

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이제부터는 장내미생물–면역계 상호작용 분석 툴들을 몇 가지 소개하고자 합니다. 

 

1) Dual RNA-seq

 

Dual RNA-seq은 숙주 세포 내로 침투한 병원균(intracellular pathogen)과 병원균에 감염된 숙주 세포(infected host cell)의 유전자 발현을 동시에 프로파일링할 수 있는 접근법10)입니다.

 

 

Dual RNA-seq of pathogen and host - PubMed

 

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Dual RNA-seq에서의 매핑(mapping)은 '순차 매핑'과 '결합(concatenated) 매핑'으로 구분되는데요. 순차 매핑은 먼저 숙주 세포의 참조 서열을 대상으로 매핑을 한 뒤 나머지 미매핑 리드를 병원체에 정렬하는 방식으로 진행되고, 결합 매핑은 두 게놈을 이어붙여 단일 인덱스를 생성하는 방식으로 진행됩니다. 여기서 결합 매핑은 두번 정렬해야 하는 순차 매핑에 비해 한번만 정렬하기에 분석을 빠르게 진행할 수 있지만 숙주세포와 병원체 간 동일/유사 서열에 대한 다중 매핑 문제가 발생할 수 있다는 한계가 있습니다. 따라서 데이터의 특성과 연구 목표에 적합한 매핑 방식을 선택하면 될 듯합니다.

 

매핑 후 숙주세포와 숙주세포에 침입한 병원체의 서열을 동시에 분석하게 되면, 각각에 대한 유전자 발현 패턴을 이해하고, 그로부터 감염 혹은 공생 시 나타나는 숙주세포와 병원체 간의 상호작용 양상을 이해할 수 있습니다. 예로, 상피세포는 미생물이 침입했을 때 어떤 항미생물 유전자 발현을 유도하는지를 파악할 수 있고, 미생물은 세포 내에서 어떤 영양분 흡수 유전자를 활성화하는지 파악할 수 있습니다. 물론 이러한 Dual RNA-seq은 숙주 세포의 리드가 너무 많거나 병원체 read가 너무 적을 경우 분석이 어려울 수 있다는 한계점이 있습니다. 또한, 세포 유형을 구분하는 것이 아닌 샘플 전체(bulk) 수준에서 유전자 발현을 비교하기에 FACS로 특정 세포 유형을 선택해 분석한 것이 아니라면 어떤 세포 유형에 미생물이 침입하였는지 알기 어렵습니다. 이를 보완하기 위해 또 다른 방식들이 등장했는데, 그 중 하나가 바로 'INVADE-seq'입니다.

 

 

2) INVADE-seq

 

Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer - PMC

 

INVADE-seq(invasion–adhesion-directed expression sequencing)은 10X Genomics의 5' scRNA-seq 프로토콜에 세균 16S rRNA를 표적으로 하는 프라이머를 추가함으로써 인체 조직 내에 세균이 침입하거나 부착된 세포들을 단일세포 해상도로 식별할 수 있게 한 최근(2022년)에 공개된 툴11)입니다. 참고로 세균의 RNA는 사람의 RNA와 달리 폴리A 꼬리(AAA..)가 없어 기존의 3' 말단 프로토콜(beads의 oligo dT에 상보적 결합)로는 캡처되지 못하는데요. INVADE-seq은 세균에게 특이적으로 나타나는 16S rRNA를 표적으로 하는 프라이머를 프로토콜에 추가함으로써 이를 가능하게 했습니다. 본 툴을 공개한 연구진들은 초록에서 다음과 같이 말합니다.

 

We developed a single-cell RNA-sequencing method that we name INVADE seq (invasion–adhesion-directed expression sequencing) and, by applying this to patient tumours, identify cell-associated bacteria and the host cells with which they interact, as well as uncovering alterations in transcriptional pathways that are involved in inflammation, metastasis, cell dormancy and DNA repair. 11)

 

 

결국 INVADE-seq은 custom 16S rRNA 프라이머를 이용해 세균을 특이적으로 캡처함으로써 단일 세포 수준에서 미생물 존재를 정밀 검출하고, 동시에 해당 숙주 세포의 전사 프로그램 변화를 조명할 수 있는 툴입니다. Dual RNA-seq과  비슷한 느낌이죠. 그렇지만 차이가 있습니다. 앞서 Dual RNA-seq은 bulk 수준에서 우연히 캡처된 세균의 mRNA을 시퀀싱 하는 것이었다면, INVADE-seq은 단일 세포 수준에서 16S 타깃 프라이밍을 통해 단 1마리의 세균이 침입했을 때도 검출 가능한 높은 민감도로 세균의 RNA를 시퀀싱할 수 있는 방법입니다.

 

암세포와 면역세포 중 일부는 세균을 함유하고 있는데요. 한 연구12)에서는 이러한 세포들이 주변 세포에 비해 염증성 사이토카인을 높게 발현하는 등 독특한 전사체 프로파일을 보임을 INVADE-seq을 통해 확인했습니다. 챗GPT가 말하길, 앞으로 Spatial-INVADE seq을 통해 10x Visium & Stereo-seq 슬라이드에 16S 프라이머 적용함으로써 종양-미생물 공간 네트워크를 재건하는 방향으로 나아갈 것으로 예측된다고 합니다. 공간 전사체 분석에 대한 설명은 아래 영상을 참고하시길 바랍니다.

 

 

 

위의 영상에서 소개하듯 공간 전사체(spatial transcriptomics) 분석은 '공간 전사체 데이터'와 '단일세포 전사체 데이터'를 통합하여 세포 공간 배치를 토대로 세포별 유전자 발현을 추론합니다. 대표적인 툴로는 Cell2Location, novoSpaRC 등이 있는데요. 장내미생물과 숙주 면역계 상호작용 분석 측면에서 본 기술은 장 조직에서 특정 미생물 밀집 부위에 어떤 세포에서 어떤 유전자 발현 패턴이 나타나는지 추정하는 연구에 활용되고 있습니다.

 

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예로, 조직 슬라이드 한 장에서 숙주 전사체(폴리-A mRNA)와 미생물 16S rRNA를 동시에 포집해 공간 좌표가 보존된 상태에서 '숙주-미생물 지도'를 생성하는 최신 공간전사체학 기법인 SHM-seq (Spatial Host-Microbiome Sequencing)이 등장했습니다.

 

 

Spatial host-microbiome sequencing reveals niches in the mouse gut - PubMed

 

 

본 기술은 2023년 Nature Biotechnology에서 생쥐 장(ileum–colon) 모델로 첫 공개13)되었는데요. 구체적으로 본 연구진은 SHM-seq으로 생쥐 장조직을 분석하여 세포 조성 및 미생물 분포에 따른 공간적 니치(spatial niche)를 식별하였습니다(딥러닝 모델을 이용해 공간 데이터를 매핑). 그 결과, 장내 미생물이 풍부한 점막 부위의 상피세포에서 특정 유전자 프로그램(ex. 점액단백 Muc2 증가, 전사인자 Satb2 감소)이 활성화되는 등 미생물 군집의 지리적 분포에 따른 숙주 세포 반응차이를 확인할 수 있었다13)고 합니다. 이는 한 개의 세포로부터 전사체 정보와 공간 정보를 동시에 획득하는 다중 오믹스(Multi-omics) 접근법이라고 할 수 있겠습니다. 공간 전사체 분석에 대해 딥리서치는 다음과 같이 전망합니다.

 

향후 장내미생물과 면역계의 단일세포 수준 상호작용 연구에서는 몇 가지 방향으로의 발전이 예상됩니다. 첫째, '공간 다중오믹스(spatial multi-omics)'와의 접목이 가속화될 것입니다. 이미 2025년 보고된 연구에서는 MicroCart*라는 파이프라인을 통해 장 조직에서 미생물 표적 올리고 프로브를 디자인하고, 이를 활용한 공간 단일세포 프로테옴(MIBI-TOF) 및 공간 전사체(GeoMX DSP) 분석을 수행함으로써, 장내 세균의 공간 분포와 면역 미세환경을 동시에 파악하였습니다17). 이러한 공간 분석 툴은 향후 조직 맥락을 고려한 미생물-면역 상호작용 연구에 큰 기반이 될 것입니다. 다만 아직은 마우스 조직에서의 실증에 그쳤는데, 해당 방법을 인체 조직에도 확장하고 검증하는 작업이 남아 있습니다. 성공적으로 인간 조직에 적용된다면, 장내미생물과 면역세포의 공간적 상호작용 지도를 얻어내어 질병의 미세환경 이해를 한층 높일 수 있을 것입니다. 

 

* 참고로, MicroCart는 복잡한 분석 절차를 하나로 묶은 라이브러리입니다. 앞으로 이렇듯 툴 공개에 있어 분석 워크플로우를 통합적으로 제공함으로써 사용자 친화성을 높이는 방향으로 기술 표준화 및 오픈소스화가 진행되며 연구자들의 기술 접근성이 향상될 것으로 예측됩니다(딥리서치 참조).

 

다중 오믹스 접근법에는 세포의 전사체 정보와 염색질 접근성 정보를 모두 측정하는 scRNA-seq + scATAC-seq 동시 분석(10X Genomic Multiome 플랫폼) 방법도 있습니다. 본 접근법을 활용하면 특정 세포 유형에서  무균 대비 정상 마이크로바이옴 환경에서 더 열려있는 특정 전사인자 결합 자리가 어디인지를 확인할 수 있고, 그로부터 해당 세포의 유전자 발현을 scRNA-seq 결과와 통합하여 보다 정밀하게 추론할 수 있습니다. 즉, scATAC-seq을 활용하면 미생물 자극에 따른 후성유전적 변화를 단일세포 수준에서 확인할 수 있습니다. ATAC-seq의 원리는 아래 영상을 참고하시면 도움이 되실 듯합니다.

 

 

 

 

3) SAHMI

 

2023년에 발표된 SAHMI(Single-cell Analysis of Host-Microbiome Interaction)는 표준 단일세포 또는 공간 전사체 데이터에서 검출된 미생물 유래 시퀀스들을 오염과 실제 신호로 구분하여 진정으로 존재하는 미생물만을 걸러내는 통계적 방법(computational pipeline)14)입니다. 이를 통해 실험적/시스템적 오염에 기인한 거짓 양성 신호를 대폭 줄여 신뢰도 높게 미생물 동정을 할 수 있는데요. 실제로 SAHMI를 사용해 종양 조직 단일세포 데이터를 분석한 연구14)에서는, 종양 미세환경 내 존재하다고 알려진 세균들을 검출한 것은 물론, 해당 세균들이 어떤 면역세포 내부에 존재하는지까지도 밝힐 수 있었다고 합니다. SAHMI는 나아가 공간 전사체 데이터에도 적용되어 조직 절편 내 미생물 분포와 주변 조직 반응을 함께 분석하는데에도 활용되었으며15), 이는 단일세포 해상도로 숙주-미생물 상호작용을 지도화하는데 있어 SAHMI의 잠재력을 입증한 사례로 볼 수 있겠습니다.

 

 

GitHub - sjdlabgroup/SAHMI

 

 

 

4) Microbe-seq

 

2022년 Science지에 보고된 Microbe-seq는 장내미생물을 개별 세포로 보고, 개별 미생물의 유전체를 시퀀싱하는 기법16)입니다. Microbe-seq에서는 미생물 세포들을 마이크로드롭릿에 봉입하여 DNA를 증폭하고, 드롭릿 특이 바코드를 붙여 대량으로 시퀀싱함으로써, 한 사람의 장내미생물 시료에서 수만 개의 단일미생물 유전체를 동시 확보합니다(링크 논문 이미지 참조).  마치 단일 세포 수준에서 유전자 발현 패턴을 파악하는 scRNA-seq처럼 단일 미생물 수준에서 유전자 발현 패턴을 파악하는 single cell microbiome sequencing 기술이라고 볼 수 있겠습니다. 본 기술은 장내 공생 세균들의 균주 수준 다양성을 해상도 높게 파악하는데 도움을 줄 수 있는 것은 물론, 미생물들 사이의 수평적 유전자 전달(HGT) 네트워크나 특정 박테리오파지-세균-숙주 연관성까지도 밝혀낼 수 있다16)고 하는데요*. 이러한 단일미생물 게놈 분석 기술은 직접적인 숙주 면역세포 분석은 아니지만, 어떤 미생물이 어떤 기능 유전자를 가지고 있는지를 밝혀내어 결국 숙주와의 상호작용 기전을 이해하는 데 기여할 수 있을 것으로 기대됩니다.

 

* 박테리오 파지는 세균을 공격하는, 세균을 숙주로 하는 바이러스로, 병원균을 선택적으로 공격하는 박테리오파지를 이용하는 '파지요법'이 세균 감염에 대한 잠재적 치료 요법으로 각광받고 있다19)고 합니다.

 

GitHub - shijiezhao/Microbe-seq: Single-cell genomic sequencing of the human gut microbiome

 

 

5) CSI-Microbes

 

CSI-Microbes(Computational identification of Cell-type-specific Specific Intracellular Microbes)는 표준 scRNA-seq 데이터 안에 섞여 들어간 세균 및 바이러스 RNA를 찾아내고*, 이를 세포 바코드 수준으로 정량화 및 해석할 수 있도록 한 미생물 리드 식별 파이프라인(open source)입니다. 특히, 본 기술은 '세포 내 미생물 풍부도'와 더불어 '감염 연관 숙주 경로 분석'을 통합적으로 제공해주기에 종양, 감염, 장내 염증 연구자에게 특히 유용한 파이프라인이라고 합니다. 활용 사례로, CSI-Microbes를 통해 종양 미세환경의 특정 면역세포(대식세포 등)에 세균 유래 리드가 풍부하다는 것을 발견했다18)고 합니다. 이는 종양 내 미생물이 주로 어떤 면역세포와 연관되어 있는지 밝힌 사례로, 향후 미생물 표적 항암 전략 연구에 중요한 단서를 제공할 것으로 기대되고 있습니다.

 

* 바이러스는 16S rRNA를 갖고 있지 않기에 16S rRNA를 표적으로 진행되는 INVADE-seq으로 바이러스의 RNA를 캡처하긴 어렵습니다. 반면, CSI-Microbes는 일반 scRNA-seq 라이브러리대로 진행되며, 참조 DB에 있는 바이러스 서열을 기준으로 미매핑된 리드를 재분석하기에 바이러스 RNA까지 식별할 수 있도록 했다고 합니다.

 

 

Identification of intracellular bacteria from multiple single-cell RNA-seq platforms using CSI-Microbes - PMC

 

 

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종합적으로 봤을 때, '장내 미생물과 숙주 면역계 간의 상호작용' 분석 관련 툴은 병원균이 침입한 숙주 세포를 대상으로 숙주세포와 병원균의 RNA를 동시에 캡처해냄으로써 그들의 상호작용 양상을 정밀도 높게, 공간 정보까지 포함하여 파악하는 방향으로 발전해가고 있는 듯 합니다. 즉, 단일세포 데이터 속 숨겨진 미생물 신호를 신뢰도 높게 끌어내고, 이를 숙주 면역 반응과 연결짓는 것이 가능해지는 방향으로 분석 기술이 발전하고 있는 추세인 듯합니다. 이외에도 Microbe-seq과 같이 개인의 장내 미생물 조성을 보다 높은 해상도로 파악할 수 있는 기술도 개발되는 등 장내 미생물 조성과 질병 메커니즘 간의 인과적 관계를 이해하려는 시도들도 다방면에서 이루어지고 있습니다. 생물학적으로 보면 미생물 자체 말고도 미생물 유래 대사산물도 숙주 세포의 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 미생물이 숙주 세포에 미치는 영향을 분석할 때 대사체 정보도 통합해서 분석하면 장내미생물과 숙주 세포 간 다면적인 상호작용 네트워크를 보다 신뢰도 높게 재구성할 수 있을 것으로 기대되고 있습니다. 무엇보다 이제는 AI의 시대입니다. 딥리서치는 다음과 같이 말합니다.

 

 

데이터 통합과 머신러닝 활용이 중요해질 것입니다. 단일세포 전사체, T/B세포 수용체 시퀀싱, 미생물 메타유전체/메타전사체, 대사체 등의 데이터를 통합 분석하여 다면적인 상호작용 네트워크를 재구성하는 시도가 늘고 있습니다. 예를 들어, 한 연구에서는 단일세포 전사체와 미생물 군집 데이터를 합쳐 스택드 앙상블 머신러닝 모델을 학습시켰고, 그 결과 장염의 예후를 예측하는 데에 미생물 시그니처(예: Proteobacteria의 증감)가 가장 중요한 특징 중 하나로 나타나기도 했습니다. 향후에는 이러한 AI 기반 분석을 통해 방대한 다중오믹스 데이터에서 핵심 상호작용(장내미생물과 숙주 면역 간) 인자를 도출하고, 이를 토대로 새 가설을 생성하는 연구가 활발해질 것으로 보입니다. 

 

 

이외에도 장내미생물-면역 상호작용은 정밀 의료에 적용할 수 있을 것으로 기대됩니다. 이에 대해 챗GPT 딥러서치는 다음과 같이 말합니다.

 

 

단일세포 수준의 장내미생물-면역 상호작용 지표들은 향후 질병 진단이나 예후 예측의 바이오마커로 활용될 가능성이 있습니다. 예를 들어 특정 장내 세균과 상호작용하는 장 점막의 면역세포 아형 비율이 질병 악화와 연관된다면, 단일세포 분석으로 해당 지표를 측정하여 환자 별 위험도 층화(stratification)에 사용할 수 있을 것입니다. 또한 환자 장 조직에서 유해균을 포착한 면역세포를 단일세포 수준에서 확인하고 이를 제거하거나 조절하는 치료 전략을 떠올릴 수 있습니다. 이를 위해서는 현재의 연구들이 더 많은 환자 코호트에서 반복 검증되고, 미생물-면역 상호작용이 인과적으로 질병에 미치는 영향을 규명하는 전임상 실험과의 피드백이 중요할 것입니다. 

 

 

최근에 장 조직의 면역세포와 상피세포 수만~수십만 개를 단일세포 수준에서 프로파일링하여 세포 유형 지도를 구축한 뒤 건강한 상태와 질병 상태를 비교할 수 있도록 하는 '인체 장 세포 아틀라스 구축(Human Gut Cell Atalas, HGCA)'과 같은 대규모 프로젝트들이 진행되고 있습니다. 장에서 장내미생물의 존재를 빼놓는 건 햄 없는 부대찌개를 먹는 것과 비슷하다고 생각합니다. 앞서 말했듯 장내 미생물은 장 세포들과 끊임없이 유기적인 상호작용을 하고 있고, 우리의 몸은 장내 미생물이 없으면 제대로 기능하지 못하기 때문입니다. 결국 장내미생물의 균형을 유지하는 것이 우리 몸의 건강을 지킬 수 있는 방법이고, 장내미생물의 불균형은 몸 곳곳의 질환 발병 및 악화에 영향을 미칠 수 있다고 볼 수 있겠습니다. 다행히도 장내미생물 조성은 비교적 쉽게 변화시킬 수 있는 것 같습니다. 따라서 장내미생물이 장 세포에 어떤 영향을 미치는지에 대한 '숙주-장내미생물 지도'까지 장 지도에 통합하게 되면, 본격적인 장내미생물 기반 정밀의료 시장을 열리지 않을까 싶습니다.

 

그렇지만 아직 대부분의 연구가 마우스 모델에 그치고 있고, 인과성이 아닌 상관관계 수준에서만 장내미생물과 질변 간의 관계 분석이 입증된 것이 대부분이기에 연구를 통해 밝혀나가야 할 부분은 많은 상황인 듯합니다. 그러면서도 장내미생물에 대한 이해는 건강하게 오래살고자 하는 우리 모두의 목표를 위해 굉장히 중요한 만큼 해당 영역의 기초 연구 및 기술 개발에 대한 충분한 투자 및 지원이 중요할 것입니다. 기회는 위기에서 오듯 어려우면서도 중요한 영역에 대한 도전은 큰 가치를 만들어 낼 수 있습니다.

 

무엇보다 이제는 AI의 시대입니다. 그러면서도 AI 자체가 주인공이라기보다 AI를 특정 분야에 융합함으로써 커다란 가치를 만들어 낼 수 있는 시대입니다. 저는 장내미생물과 숙주 면역 간의 상호작용 메커니즘 규명에 있어서 AI가 앞으로 본 영역에서의 커다란 가치를 만들어 낼 수 있을 것이라고 생각합니다. 그러려면 우리에게 닥친 문제 해결에 필요한 가치 있는 질문을 던지고, 그 질문에 대해 AI를 활용해 올바른 답을 찾아낼 줄 아는 사람들이 충분히 필요할 것입니다. 이것으로 본 글을 마치도록 하겠습니다. 감사합니다!

 

 

 

- 참고자료

 

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