오늘은 6일차에 정리한 RNA splicing에 이어, RNA interference에 대해 정리해보는 시간을 가져보겠습니다.
[대학원 준비 6일차] mRNA splicing, Exonic splicing enhancers(ESEs), 그리고 self-splicing
오늘은 전에 5' capping과 3' tailing으로 만들어진 pre-mRNAs가 mature mRNAs가 되기 위해 필요한 RNA splicing 절차에 대해 소개해보도록 하겠습니다. [대학원 준비 5일차] transcription in eukaryotes, 5' methyIguano
tkmstudy.tistory.com
RNA interference는 작은 RNA 조각이 mRNAs에 결합함으로써 타깃으로 하는 protein translation을 억제하는 현상1)을 말하며,
exogenous genes의 침입에 대한 natural defense mechanism으로 역할2)을 합니다.
작은 RNA 조각은 small interfering RNA (siRNA)와 microRNA (miRNA)로 구분됩니다.
RNA interference에는 target mRNA의 서열을 코딩하는 sense RNA와 target mRNA의 상보 서열을 갖는 anti-sense RNA를 포함하는 'double-stranded RNA(dsRNA)'가 역할을 하며
dsRNA-mediated RNA interference는 small RNAs가 gene expression을 억제하는 RNA silencing의 현상의 사례입니다.
아래 영상에서는 세포 환경에서 RNAi가 이루어지는 현상을 애니메이션으로 잘보여주고 있습니다.
그렇다면 posttranscriptional RNA sliencing이 어떤 방식으로 이루어지는지 'small interfering RNA (siRNA)'부터 pathway를 영상으로 만들어봤습니다.
정리하자면 우선 dsRNA에서 Dicer에 의해 21~23 nt 사이즈의 3' overhanging ends를 가진 두 가닥의 siRNA가 만들어지고나서
Argonaute protein(Ago2)을 가진 pre-RISC complex가 siRNA에 붙게 되는데 이때 Ago2는 siRNA의 passenger strand를 잘라내어 제거할 수 있는 능력이 있습니다.
이후 RISC complex와 연관된 단일 가닥의 siRNA는 상보적인 target RNA에 결합하게 되고, Ago2의 ribonuclease acitivity에 의해 tartget RNA는 잘라내지고 분해됩니다.
선행 논문2)에 따르면 현재 이 siRNA을 therapeutic target으로 활용하기 위해 어떻게 하면, 효율적이고 안전하게 siRNAs를 원하는 tissues나 cells로 전달할 수 있을지,
그리고 어떻게 하면 siRNAs의 performance(ex. activity, stability, specificity, potential off-target effects)를 향상시킬 수 있을지 연구가 이루어지고 있다고 합니다.
특히 siRNA는 mRNA와 완전한 Watson-Crick base pairing에 의해 기능을 수행하기에 특정 단백질들의 complicated spatial conformation을 인식해야 하는 small-molecule and monoclonal antibody drugs에 비해 이점이 있다고 합니다.
그렇지만, siRNA의 RISC-loaded sense strand가 다른 irrevlevant genes의 발현을 억제할 수 있는 가능성이 있고,
unformulated되고 unmodified된 siRNA는 Toll-like receptor 3(TLR3)*의 활성을 야기하고, 그렇게 blood and lymphatic system에 악영향을 미칠 가능성이 있기에 이러한 undesired affects를 방지하기 위한 연구도 이루어지고 있다고 합니다.
*Toll-like receptor 3(TLR3) : proinflammatory cytokines인 type 1 interferons(IFNs)의 transcriptional induction을 매개하는 TLR family의 멤버3)입니다.
다음으로 gene expression을 조절하는 small RNA인 miRNA(microRNA)에 의한 RNAi 절차에 대해 알아보도록 하겠습니다.
What is miRNA?
virus나 transposable element(혹은 연구자가 제공한 dsRNA)의 double-strand 산물로부터 유래된 siRNA와 달리
miRNA는 genome의 conventional segment에서 인코딩되고, 특정 mRNA를 타깃하여 translation을 억제합니다(miRNA mRNA interaction).
물론, miRNA는 translaion repression 기능 외에도 siRNA처럼 targeted mRNA degradation을 매개하기도 합니다.
결국, siRNA은 genome의 integrity를 유지하기 위해 역할을 하고 miRNAs는 gene expression을 조절하는데 주요 역할을 한다고 볼 수 있다네요.
이 둘의 차이는 siRNA는 miRNA에 비해 보다 효율적이고 특이적인 gene silencing을 유발할 수 있는 반면,
miRNA는 하나가 여러 다른 target genes의 발현을 동시에 compromise할 수 있다2)고 합니다.
그렇다면 miRNA의 RNAi pathway에 대해 영상을 통해 알아보도록 하겠습니다.
저도 공부 겸 miRNA의 RNAi pathway를 영상으로 만들어보았습니다.
말로 설명하자면, 우선 대부분 intron 영역(소량의 exon)에서 한 쪽 end에 stem-loop을 가진 double-stranded RNA가 형성되고,
이 pseudo-dsRNA(pri-miRNA)는 endonuclease인 Drosha를 포함한 protein complex에 의해 terminal loop 주변의 특정 영역에서 잘라내지고(하나의 3' overhang을 가진 형태), cytoplasm으로 exported됩니다(by exportin 5 (XPO5)/RanGTP complex).
cytoplasm에서 pre-miRNA는 Dicer에 의해 loop가 잘라내지고 양쪽에 3' overhang을 가진 형태가 만들어집니다.
이후 dsRNA에 Ago1이라는 'Argonaute protein'을 포함한 protein complex이 붙고, passenger strand가 제거되면서 miRNA가 만들어집니다.
이러한 single-stranded guide miRNA는 mRNA의 상보 영역에 붙고, 리보솜에 의한 translation을 억제하게 됩니다(miRNA targeting).
이때 miRNA는 target mRNA 영역만 번역을 억제하기에 특이적인 결합을 위해 bulge 형태를 띄게 됩니다.
그렇다면, 왜 siRNA든 miRNA든 3' overhang을 갖게 cleaved되는지 궁금하지 않나요?
논문을 찾아보니 그 이유는 3′ overhang structure가 mature RISC affinity를 유도해mRNA의 desired target에 상보적이게 하여, 원치않은 가닥에 off-target sliencing하는 가능성을 줄이는데 도움이 되기 때문4)이라고 하네요.
아무튼간에 그렇게 만들어진 miRNAs는 앞서 말했듯 gene expression을 조절하는데 주요 역할을 하여, 다양한 세포 유형들의 분화, 세포 증식과 death의 제어, 그리고 cancer의 발달에도 주요 역할을 하게 됩니다.
참고 생물정보학 분석 방법으로 miRNA의 표전 유전자를 예측하는 것은 miRNA가 수많은 표적 유전자를 조절할 뿐만 아니라 동물이나 식물에 있어 miRNA와 표적 유전자 간의 상보적인 결합 기작이 다르기 때문에 어렵다고 하는데,
구체적으로 동물에서의 miRNA는 표적 유전자의 3' UTR에 결합하는 반면, 식물에서의 miRNA는 coding region에 결합하는 것으로 알려져 있다고 하며,
동물에서의 miRNA는 식물의 방식과 달리 모든 염기가 완전히 표적 유전자와 결합하는 것이 아니라, 몇 개의 염기만 부분적으로 결합을 이루게 된다5)고 하네요.
또한 선행 논문6)에 따르면, 앞서봤듯 특정 조건에서 miRNAs가 post-transcription을 통해 translation을 활성화하거나 제어하는데에도 영향을 줄 수 있는 것은 물론,
extracellular miRNAs는 cell-cell communciation의 chemical messengers로서 역할을 할 수 있다고 합니다.
그렇기에 miRNA의 aberrant expression은 많은 human disease와 연관이 되어 있고, 일부 extracellular miRNAs는 다양한 질병들의 potential biomarkers로 보고되기도 하였다고도 합니다.
구체적으로, miRNAs는 siRNAs처럼 Toll-like receptors와 같은 cell surface receptors와 상호작용하며, hormone-like activities를 갖는다고 합니다.
그리고 miRNAs의 활성에 영향을 주는 요인으로는 subcellular location, miRNA/mRNA abundance, miRNA:MRE* affinity, cell type/state, 그리고 다양한 miRISC components의 이용 가능성이 있다고 합니다6).
*MRE : miRNA response elements
다음으로는 bacteria의 noncoding RNA이자 21세기 최근 들어 핫하게 주목 받은 CRISPR에 대해 알아보도록 하겠습니다.
참고자료
1) Ask A Scientist Staff, What is RNAi?, Thermo Fisher SCIENTIFIC, 2019
What is RNAi?
RNAi refers to a phenomenon where small pieces of RNA can shut down protein translation by binding to messenger RNAs that code for those proteins.
www.thermofisher.com
2) Hu, B., Zhong, L., Weng, Y. et al. Therapeutic siRNA: state of the art. Sig Transduct Target Ther 5, 101 (2020).
3) Chen Y, Lin J, Zhao Y, Ma X, Yi H. Toll-like receptor 3 (TLR3) regulation mechanisms and roles in antiviral innate immune responses. J Zhejiang Univ Sci B. 22(8):609-632 (2021).
4) Park JH, Hong SW, Yun S, Lee DK, Shin C. Effect of siRNA with an asymmetric RNA/dTdT overhang on RNA interference activity. Nucleic Acid Ther. 24(5):364-71 (2014).
5) 이광희, 마이크로 RNA의 생물정보학적 분석 및 연구방법, 질병관리청
6) O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of MicroRNA Biogenesis, Mechanisms of Actions, and Circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9:402. doi: 10.3389/fendo.2018.00402 (2018).
