안녕하세요 이번 글에선 CRISPR-Cas9에 대해 정리해보는 시간을 가져보겠습니다.
우선 배경지식을 설명하자면, 많은 bacteria의 genome엔 bacteriophage viruses의 DNA로부터 유래된 sequences와 동일한 short DNA segements를 repeated DNA sequence에 의해 구분된 array 내부에 포함하는데, 이것은 뒤에도 설명하겠지만 적응성 면역을 위한 절차입니다.
여기서 repet loci를 Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)라고 하며, CRISPR에서 전사가 이루어져 crRNA(CRISPR RNA)가 만들어지게 됩니다.
이 crRNA와 trancrRNA가 sgRNA를 이루고, nuclease(DNA cutting protien)인 Cas9도 붙어 Cas9 complex를 이루어서 DNA의 specific site를 cut하게 되는데, 이를 CRISPR-Cas9 system이라고 합니다.
본 시스템은 유전자 편집 (DNA 삽입, 제거, 대체)이 수월하다는 장점이 있어 21세기 들어 큰 주목을 받았습니다.
특히 해당 시스템은 설계하기 쉽고, highly specific하고, 효율적이고, 다양한 cell types와 organisms를 위한 high-throughput & multiplexed gene editing을 위해 적합하다는 장점이 있다1)고 합니다.
CRISPR-Cas는 phages의 감염을 막는 대부분의 bacteria와 archea에 존재하는 adaptive immune system(적응성 면역)이라고도 볼 수 있는데,
Cas protein이 phages의 foreign DNA의 short fragements를 잘라서 CRISPR array에 보관하다가 같은 침입자가 다시 왔을 때 sgRNA가 이것을 빠르게 인식해서 Cas protein의 도움으로 foreign DNA에 pair하고 제거할 수 있어 host를 보호할 수 있기 때문입니다2).
본 논문2)에 따르면, Cas9에 의해 만들어진 double-stranded break(DSB)는 두 개의 endogenous self-repair mechanisms에 의해 repair된다고 하는데 각각 non-homologous end joining(NHEJ) pathway와 homolgy-directed repair (HDR) pathway입니다.
NHEJ는 cleavage sites에 randome insertions나 deletions을 유도하여 target genes의 ORF(open reading frame) 안에서 frameshift mutations를 유도하거나 premature stop codons 생산을 유도하는데 활용할 수 있다고 합니다.
NHEJ를 통해 DSB가 repair되는 메커니즘은 아래 영상을 참고하시면 되겠습니다.
위 영상에서 설명하듯, NHEJ가 꼭 필요한 이유는 DSB가 cytotoxic DNA damage에 취약할 뿐만 아니라
unrepaired DSB는 replication의 blocking을 유발하고, chromosome segment의 loss, 그리고 Apoptosis를 유발할 수 있기 때문입니다. 당연한 말이긴 하죠.
반면, HDR은 homologous DNA repair template을 사용함으로써 target site에 precise genomic modifications을 유도합니다.
HDR을 통해 DSB가 repair되는 모습은 아래 영상을 보시면 직관적으로 이해되실 것 같습니다.
다시 돌아와서 CRISPR-Cas systems는 pathogenic mutations를 교정하거나 cancer immunotherapy를 위한 핵심 유전자를 찾는 데 활용될 수 있다는 점에서 과학기술의 발전에 큰 진보를 가져왔지만
아직 본 시스템이 potential off-target effects가 있고, PAM sequences*에 의해 제한되는 만큼 limited genome-targeting scope를 갖는다는 점에서 한계가 있어서 많은 연구팀이 본 tool의 efficency와 specificity를 높이기 위해 고군분투하고 있다고 합니다2).
*PAM 서열 : target DNA 서열 인근에 위치하며 guide RNA가 인식할 수 있는 서열로, 이를 통해 Cas9가 target DNA에 결합하고 cut할 수 있도록 합니다.
위 영상은 CRISP Cas9 gene editing works로 2020년도에 노벨상을 받은 Doudna와 Charpentier와의 인터뷰 영상인데
영상을 보니 Cas9, crRNA는 물론, tracrRNA도 함께, 즉, crRNA-tracrRNA duplex를 만듦으로써 본 시스템의 기능을 높일 수 있었던 것 같습니다.
영감도 주는 인터뷰인 것 같아서 시간되실 때 한번 보시길 추천드립니다!
이것으로 transcription에 대한 정리를 마치고, 이젠 translation 관련 이론을 복습해보는 시간을 가져보겠습니다.
참고자료
1) Ran, F., Hsu, P., Wright, J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281–2308 (2013)
2) Xu Y, Li Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Comput Struct Biotechnol J. 18:2401-2415 (2020).
