이번 글에서는 전 글에 이어 논문 관련 이론 정리를 하는 시간을 가져보도록 하겠습니다.
[12일차] 논문 관련 이론 정리 :: Tet-On & Tet-Off System, IRES와 2A peptide
전 글에서 말씀드렸듯이, 요즘 Zotero를 활용해 논문 하나를 제대로 분석해보는 연습을 하고 있습니다. [11일차] 대학원 준비생을 위한 'Zotero'를 활용한 논문 학습 방법안녕하세요, 오늘은 어제
tkmstudy.tistory.com
3. Chromogenic Immunohistochemistry & Immunofluorescence(IF)
이 두가지는 Immunohisochemistry 방식으로 reporter로 발색 침전물을 생성하는 '효소'를 활용하느냐 발광하는 '형광 물질'을 활용하느냐에 차이가 있지만, 그래도 둘다 'Immuno-'가 앞에 붙는 만큼 몸의 면역 원리(항원 항체 반응)를 활용해 원하는 타깃을 가시화하는 방법으로 볼 수 있습니다.
먼저 Chromogenic Immunohistochemistry(IHC)는 효소가 부착된 특정 항체(하나의 항체 또는 1차 및 2차 항체를 조합하여 사용)를 사용하여 조직 샘플에서 특정 항원의 분포 및 발현 정도를 측정하는 방법인데요,
항원 항체 반응이 일어나면 항체에 붙은 효소가 활성화 되고 그러면 이후 기질을 넣어주었을 때 효소가 기질과 반응해 발색성 침전물을 생성하기에 항원의 분포 및 위치를 확인1)할 수 있습니다.
참고로, IHC의 효소로 사용되는 Horeseradish peroxidase (HRP)은 기질(substrates)의 oxidation을 촉매하여 colored product를 생성하는데, 그 기질로 사용되는 것 중 DAB(3, 3'-diaminobenzidine)은 Brown에서 black 색깔을 띈다고 하고(near-neutral pH에 최적화),
Alkaline phosphatase(AP)는 substates로부터의 phosphate groups의 hydrolysis를 촉매하여, colored product를 생성하는데 , 기질로 사용되는 것 중 Fast Red는 빨간색을 띈다2)고 합니다(basic pH(pH 8~10)에서 최적화).
비교해보면 Antibody-HRP conjugates가 antibody-AP conjugates보다 enzyme과 anitbody의 특정 활성 측면에서 우수하면서도 안정적이고 비용도 낮고 HRP에 사용할 수 있는 substrates도 다양해서 여러 이점이 있다2)고 하네요.
아래 영상에서 Immuno histochemistry의 개념에 대해 잘 설명해주고 있으니 참고바랍니다.
다음으로 Immunofluorescence(IF)는 효소 대신 fluorophores(형광단)이 tag된 특정 항체를 사용하며, 항원 항체 반응을 통해 주어진 tissue 혹은 cell type에서 많은 구성성분들을 발광을 통해 시각화하는 방법으로 '신호 증폭(signal amplification)'과 '민감성(sensitivity)' 차원에서 chromogenic IHC보다 우수하다3)고 합니다.
다시 말해, chromogenic IHC는 항체가 항원에 결합하면 항체에 붙어있던 효소가 활성화되어 기질이 붙을 수 있어 발색 물질을 생성할 수 있다면, IF는 항체가 항원에 결합하면 항체에 붙어있던 형광단이 활성화되어 빛을 조사했을 때 형광을 나타내게 되는 것입니다.
참고로, 가장 흔히 사용되는 fluorophores는 'fluorscein isothiocyanate(FIT)'와 'tetramethylrhodamin isothiocyanate(TRITC)'라고 합니다3). 아래 영상을 보시면 IF가 무엇이고, 어떻게 절차가 진행되는지 쉽게 이해하실 수 있지 않을까 싶습니다. 무엇보다 본 영상에선 '몸'이라는 세계에서 몸을 구성하는 세포와 단백질들이 어떤 구조를 이루고 어떤 기능을 하는지 추적할 수 있다는 점을 강조한게 재밌었습니다.
이러한 immuohistochemistry 방식은 발색인지 형광인지는 물론 직접인지 간접인지로도 구분이 되는데요, 직접법(direct method)은 1차 항체를 표지하여 반응시키는 방법으로 특이성(specificity)은 우수하지만 민감도(senstivity)는 좋지 않아서(신호 증폭이 이루어지지 않아서 신호가 약함) 항원과 높은 반응성을 가진 항원이 있을 때 사용하면 좋고,
간접법은 1차 항체를 미표지 상태로 항원과 반응시키고, 2차 항체를 표지하여 간접적으로 반응시키는 방법으로 비특이적인 반응은 일어날 순 있지만 '신호 증폭'이 이루어져서 민감도가 우수하고 용도가 넓어 널리 사용되고 있다고 합니다4). 결국, 항원이 많고 빠르게 결과를 얻고 싶으면 direct IHC, 항원이 적고 우수한 민감도로 항원을 검출하고 싶으면 indirect IHC를 활용하면 될 것 같습니다.
지금 읽고 있는 논문0)에서는 intestine section과 intestinal organoid의 세포들을 관찰하기 위해 IHC와 immunofluorescence를 모두 민감도가 우수한 indirect method 방식으로 사용했는데, IHC의 경우 horseradish peroxidase를 사용했고, 기질은 앞서 말한 brown 색을 띠는 DAB를 사용했습니다.
중요한건 IHC를 수행하기 위해서 endogenous peroxidase activity를 3% H2O2로 blocking했다고 하는데, endogenous peroxidase는 많은 세포에 자연적으로 존재하면서 HRP처럼 DAB라는 chromogen과 반응하여 염색을 유도할 수 있기에 정확한 염색 결과를 얻는데 방해할 수 있기에 비활성화시킨다5)고 합니다.
또한, 핵 염색을 위해서는 hematoxylin을 사용했는데, hematoxylin은 산화되면 aluminum ions와 결합하여 active metal-dye complex를 이루어 nuclear histones의 lysine residues에 결합하여 mammalian cells의 핵을 blue로 염색한다6)고 합니다.
참고로 hematoxylin는 H&E(Hematoxylin and eosin) staining에 활용되는데 Hematoxylin이 앞서 말했듯 핵을 blue-purple color로 염색하고, Eosin은 비특이적으로 단백질들을 핑크로 염색해서, 결과적으로 조직에서 핵은 파란색으로 다른 세포질이나 ECM은 핑크로 염색시키는 최소 한 세기는 사용된 역사가 깊은 염색법7)이라고 하네요. 아래 영상에서는 H&E staining에 대해 알기 쉽게 소개해주고 있습니다.
4. Cell fixation
cell fixation은 histochemical & cytochemical analysis를 위해 즉, 넓은 범위의 biological assay(생물 검정)을 위해 cell samples를 보존하는데 필수적인 방법8)으로 앞서 설명한 IHC와 IF를 하기 전 관찰하고자 하는 세포의 구조와 integriy를 유지하기 위한 목적으로 활용됩니다.
즉, cell fixation은 세포 혹은 cellular components를 관찰하기 위해 세포의 화학적 물리적 성질을 유지할 수 있도록 cell degradation과 같은 unexpected changes가 일어나는 것을 방지하고 life-like state로 유지될 수 있도록 해주고, 무엇보다 antibody가 intracellular structure에 접근할 수 있도록, 즉, immunostaining이 효과적으로 이루어질 수 있도록 한다8)고 합니다.
Cell fixation에 주로 사용하는 것이 4% paraformaldehyde(PFA)인데요, 파라포름알데히드는 (포름알데히드) formaldehyde의 polymer(중합체)로 파라포름알데히드 그 자체로는 단백질 고정 능력이 없고, 파라포름알데히드가 물에 녹아 열과 염기를 만나 분해되어 포름 알데히드가 되었을 때 세포 내의 단백질을 고정 역할을 한다9)고 합니다.
구체적으로, Fromaldehyde는 단백질과 DNA, chromatin proteins 등을 crosslinking(DNA base 혹은 amino acid의 nucleophilic group에 covalent bond 형성)하여 세포나 조직의 구조 및 기능을 확인10)할 수 있게 돕습니다. 4% PFA를 만드는 영상은 다음과 같습니다.
그렇다면 왜 포름알데이드를 바로 넣지 파라포름알데히드를 넣었을까 싶을 수도 있는데, 포름알데히드는 상온에서 gas 상태11)여서 실험에 사용하기 어려워서 보통 포름알데이히드의 고체형태인 PFA를 pure formaldhyde로 해리시켜 실험에 사용한다고 합니다.
본 논문0)에서는 쥐의 소장에 있어 large segments를 보게 하면서12), tissue의 integrity와 quality를 유지13)할 수 있게 하는 swiss rolling technique*을 사용하여 돌돌 만후 만든 intestine sections와 intestinal organoids를 4% PFA로 고정시키고, 30% sucrose에서 담근 상태에서 동결보존시켰습니다.
* swiss rolling technique: '여기'를 누르면, 쥐 소장을 swiss rolling하는 영상을 보실 수 있습니다. 비위가 약하신 분들은 안보시길 추천드립니다.
30% sucrose에 담군 이유는 sucrose는 샘플 준비기간 동안 cellular structure와 내용물들을 보존하는데 도움을 주기 때문14)이라고 하며, BRIC에서 어떤 분은 sucrose가 "조직을 보호하기위한 cushion 정도의 역할을 한다"15)고 비유하기도 했네요.
동결보존(cryopreservation)을 시키는 이유는 세포를 고정하고 한번만 관찰하는게 아니므로, 추후 분석을 위해 고정 즉, 세포가 죽지 않고 구조와 integrity를 유지할 수 있게 동면시키기 위함으로 추측됩니다. 그렇게 고정을 진행하고 앞서 설명한 IHC와 IF를 진행해 세포나 조직에서 원하는 타깃의 분포를 관찰하는 것이죠. 동결보존에 대한 설명은 아래 영상을 참고하시면 도움이 되실 듯 합니다.
일단 여기까지 논문 관련한 개념들을 복습하고, 다시 논문을 정독하는 시간을 가져보면서 헷갈리거나 중요한 개념들을 나중에 또 이렇게 정리해보도록 하겠습니다.
- 플러스 개념
1) dedifferentiation : 이미 분화가 완료된 세포가 후성유전학적 변화에 의해 초기 미분화 상태로 세포의 특성이 가역적으로 변하는 현상 16).
2) cell plasticity : genetic mutation 없이 phenotype을 변경할 수 있는 세포의 능력 17).
3) YAP(yes associated protein) activation : reversible pro-proliferatvie transcriptional program을 작동하여 re-epithelization과 wound bed의 regranulation 등 wound healing에 주요 역할을 하는 과정 18).
참고자료
0) Jumee Kim et al. ,Partial in vivo reprogramming enables injury-free intestinal regeneration via autonomous Ptgs1 induction.Sci. Adv.9,eadi8454 (2023).
1) BD Biosciences, Immunohistochemistry, IHC 원리 URL : https://www.bdbiosciences.com/ko-kr/learn/applications/ immuno histochemistry?tab=Overview
2) Thermofisher SCIENTIFIC, IHC immunodetection, URL : https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/ihc-immunodetection.html
3) Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods Mol Biol. ;1897:299-311. (2019).
4) 우당네트웍, Blog, 면역조직화학 염색법, URL : https://www.woodangnetwork.com/ko/posts/90
5) Bussolati, Gianni MD, FRCPath; Radulescu, Razvan Tudor MD. Blocking Endogenous Peroxidases in Immunohistochemistry: A Mandatory, Yet Also Subtle Measure. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 19(5):p 484, (2011).
6) Thermofisher SCIENTIFIC, IHC counterstains, URL : https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/ihc-counterstains.html#1
7) Fischer AH, Jacobson KA, Rose J, Zeller R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008:pdb.prot4986. (2008).
8) Kim SO, Kim J, Okajima T, Cho NJ. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4(1):5. (2017).
9) Bio통신원(찜찜이 (필명)), [힐끔 보는 MSDS] Paraformaldehyde와 formaldehyde, BRIC, 2023
10) Hoffman EA, Frey BL, Smith LM, Auble DT. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J Biol Chem. 290(44):26404-11. (2015).
11) NIH, PubChem, Formaldehyde, URL : https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Formaldehyde
12) Bialkowska AB, Ghaleb AM, Nandan MO, Yang VW. Improved Swiss- rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113):54161. (2016).
13) Airton Pereira e Silva, André Luiz Lourenço, Bárbara Oliveira Marmello, Monique Bitteti, Gerlinde Agate Platais Brasil Teixeira, Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss Roll versus Intestine Strips, Experimental and Molecular Pathology, Volume 111, 2019.
14) SCISPACE, Why is sucrose used for fixation of cells for IF?, URL : https://typeset.io/questions/why-is-sucrose-used-for-fixation-of-cells-for-if-3lacljt2fi
15) 앨리스님의 질문 답변, 조직 고정을 할때(4%paraform//sucrose), BRIC, URL : https://www.ibric.org/bric/community/qna.do?mode=view&articleNo=9676201
16) NAVER 지식백과, 분자 세포생물학백과, 역분화
17) Shen S, Clairambault J. Cell plasticity in cancer cell populations. F1000Res. 9:F1000 Faculty Rev-635. (2020).
18) Edyta M. Grzelak et.al. Pharmacological YAP activation promotes regenerative repair of cutaneous wounds. PHARMACOLOGY. 2023.
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