[대학원 준비 2일차] multiple displacement amplification(MDA) & multiple annealing and looping-based amplification cycles (MALBAC)

 

이번엔 single-cell multiomics analysis를 위한 시퀀싱 기술들을 알아보겠습니다.

 

우선 single-cell sequencing 기술들은 아래 유튜브에서 잘 설명해주었으니 영상을 보시길 추천드립니다.

 

 

 

 

아래 영상은 아주 간단하지만 그래도 multiomics에 대해 쉽게 설명해둔 것 같아 나중에 또 보려고 링크를 함께 올립니다.

 

 

 

저는 앞선 논문0)에 등장하는 기술을 소개해드리려 하며, 첫번째는 single-cell whole genome sequencing (scWGS) mehods입니다.

 

scWGS는 유전적으로 다양한 시스템인 solid tumors와 관련된 개별 세포들 사이의 genome-level molecular differences를 평가하는데 사용될 수 있는데,

이를 통해 tubmor subopoulations를 검증하고 somatic genomic copy number alterations in healthy tissues(brain 등), 

clonal dynamics(복제 역학), 그리고 tumor evoluton에 대한 이해를 향상시킬 수 있다1)고 합니다.

 

출처 : pixabay

scWGS 중 multiple displacement amplification(MDA)는 DNA를 증폭시키는 방법으로 "poisonous(유독)"한 genomic sequences를 증폭시키는데 효과적이라고 합니다.

 

챗 GPT 답변

MDA를 통한 whole genome amplification (WGA)는 quantitative PCR, SNP genotyping 등에 사용될 수 있음이 증명되었습니다.

특히, MDA에 사용되는 DNA polymerase는 PCR을 위한 TaqDNA polymerase보다 sequence error rate도 낮아 정확성도 높다2)고 합니다.

 

circular DNA molecule의 경우 MDA가 다음과 같이 이루어집니다.

 

 

 

 

 

아래는 광고 영상이긴 한데 True Prime이라는 곳에서 2017년 기준 새로 개발된 DNA primase 'TthPrimpol'과 high-fidelity인 Phi29 DNA polymerase를 활용해 MDA 방식을 통해 genomic DNA를 증폭시키는 영상입니다.

 

 

 

 

영상을 보니까, DNA polymerase가 다음 primer에 도착했을 때 falling off 되지 않고 계속 진행하면서 여러갈래의 cDNA 가닥을 만들던데

이러면 primer artefacts를 없애고, 게놈에서 amplification bias를 줄이고 훌륭한 reproducibility를 가진다고 합니다.

 

챗GPT에게 MDA의 적용 가능성을 물어보았더니 DNA 증폭을 통해 singe cell의 genome, microbial diversity 등을 연구할 수있는데 도움을 준다고 하는 것 같습니다.

 

출처 : 챗GPT

 

 

더 찾아보니 유명한 고전 기술이라 그런지 NAVER 지식백과에서 소개해주던데,

PCR에 기초하지 않은 핵산 증폭 기술로서 매우 적은 양의 DNA 시료를 신속하게 증폭할 수 있는 방법으로

PCR에 비해 증폭산물의 크기가 크며 증폭 오류도 낮다는 장점이 있지만

대립유전자 중 한 개가 무작위적으로 증폭되어 두 개의 대립유전자의 비율에 차이가 나는 현상인 'Alleic dropout(대립유전자 탈락)'이 MDA 생성물에서 자주 일어나는 한계가 있다3)고 합니다.

 

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다음으로 또 다른 sgWGS 기술, multiple annealing and looping-based amplification cycles (MALBAC)에 대해 알아보겠습니다. 

 

MALBAC은 'quasi-linear preamplification'을 도입하여 비선형적 증폭과 연견된 bias를 줄일 수 있다4)고 합니다.

 

출처 : 챗 GPT

 

 

MALBAC single cell whole genome amplification 절차는 본 논문4)에 잘 나와있습니다(링크 참조).

 

요약하면 MALBAC은 'amlicons(증폭 혹은 복제될 DNA 혹은 RNA 조각)'이 complementary ends를 갖도록 허락하는 특수한 primers를 갖는데

 

이것이 loop를 형성하고, DNA가 기하급수적으로 복제되는 것을 막아 amlification bias를 줄일 수 있다고 합니다.

 

ILLUMNIA에서도 MALBAC 절차와 장단점을 잘 요약해주었으니 참고 바랍니다.

 

 

MALBAC

 

출처 : ILLUMNIA

 

"As the amplification and annealing process is repeated, the semi-amplicons are amplified into full amplicons that have a 3’ end complimentary to the 5’ end. As a result, full-amplicon ends hybridize to form a looped structure, inhibiting further amplification of the looped amplicon, while only the semi-amplicons and genomic DNA undergo amplification" - ILLUMINA

 

 

최적화된 whole genome amplification에 있어 MDA와 MALBAC을 비교를 한 2022년 기사가 있는데요,

 

MALBAC and MDA: Optimize Whole Genome Amplification (WGA)

 

본 기사5)에 따르면 두 기술 모두 PCR보다 정확하고, 기존 기법에 비해 sequence loss나 technical artefacts와 같은 문제를 다룸에 있어 발전되었으나

MALBAK는 amplicon looping을 통해 MDA에 비해 amplification bias가 적은 편이고(MDA는 expotential amlification으로 bias 형성 가능), 

MDA는 phi29 polymerase라는 high-fideliry enzyme을 활용하기에 큰 샘플을 낮은 error로 증폭시킬 수 있다는 장점이 있다고 합니다.

그리고 MALBAC은 Taq polymerase를 쓰기에 incorporation errors에 대해 ph929에 비해 취약하다고 합니다.

그리고 이 방법들은 large genetic templates에 대해 copy number variation(CNV)나 single nucleotide variant detection을 보다 정확하게 하는데 도움을 줄 수 있다고 합니다.

 

참고로, MALBAC은 CNVs를 검출하는데 보다 정확하고(amplification bias가 낮아서), 

MDA는 mutation detection하는데 보다 효과적(phi29가 double-stranded linear DNA의 copies를 정확하게 생산해서)이라고 합니다.

 

 

사진 출처 : seqwell 홈페이지

또한, MDA는 single-nucleotide polymorphism(SNP) arrays에 효과적이라고 하는데

알츠하이머병과 연관된 장내미생물의 SNPs 데이터와 불면증과 연관된 장내미생물의 SNPs 데이터 사이에 연관성 분석을 했던지라 반갑네요.

결국 이러한 SNPs 데이터를 얻기 위해 DNA를 증폭함에 있어 MDA가 효과적인 듯 합니다.

 

"Whether you use MALBAC, MDA, or an even newer WGA method like LIANTI or META-CS will depend on your goals, the type of sample you have, and what genetic aspects you are looking for." - seqwell(동일 링크 출처)

 

 

다음으로는 시퀀싱 기술 중 single cell RNA sequencing (scRNA-seq) methods에 대해 정리해보도록 하겠습니다. 오류나 문제 있으면 알려주시면 아래 메일로 알려주시면 감사드립니다. 감사합니다!

 

 

 

참고자료

 

 

0) Lee, J., Hyeon, D.Y. & Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Exp Mol Med 52, 1428–1442 (2020)

 

1)Konstantin Queitsch, Travis W. Moore, Brendan L. O’Connell, Ruth V. Nichols, John L. Muschler, Dove Keith, Charles Lopez, Rosalie C. Sears, Gordon B. Mills, Galip Gürkan Yardımcı, Andrew C. Adey, Accessible high-throughput single-cell whole-genome sequencing with paired chromatin accessibility, Cell Reports Methods, Volume 3, Issue 11, 100625  (2023)

 

2) Dean FB, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi AF, Bray-Ward P, Sun Z, Zong Q, Du Y, Du J, Driscoll M, Song W, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken RS. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc Natl Acad Sci U S A. ;99(8):5261-6, (2002)

 

3) NAVER 지식백과, 다중이동증폭(mutiple displacement amplification)

 

4) Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 21;338(6114):1622-6 (2012).

 

5) seqWell, MALBAC and MDA: Taking a Closer Look at Optimized Whole Genome Amplification, seqWell Blog (2022)