[22일차] 초보자를 위한 scRNA-seq data 분석법 글 추천, Edu labeling, Cre-loxp system

 

이번 글에서는 읽고 있는 논문의 배경지식을 몇 가지만 정리해보고자 합니다.

 

그전에 방금전에 아래 scRNA-seq data 분석법에 대해 하나하나 아주쉽게 알려주는 BRIC 글을 찾았습니다.

 

 

[당신의 논문 동료] scRNA-seq data 분석법 - R 설치부터 Seurat까지 & Public scRNA-seq 분석 사이트 소개 |

 

 

[당신의 논문 동료] scRNA-seq data 분석법 – Plot 4 종류부터 DEG까지 | 뉴스 > Bio뉴스 > 동향 | BRIC

 

 

사실 tutorial이나 이런 글 볼 때마다 어떻게 따라해야할지 막막했는데, 이것은 정말 떠먹여주다시피 해서 공부하기 좋은 것 같습니다. 이 분이 올려주신 글들 모두 읽어보면서 따라해봐야겠습니다.

 

참고로 코딩이 어려운 분들을 위한 웹 기반 데이터 포털로 Single Cell Portal, Tabula sapiens, GTEx portal 등이 있으며 자세한 설명은 위의 BRIC 글에서 확인하시면 되겠습니다.

 

 

Single Cell Portal

 

Tabula Sapiens

 

 

방대한 양의 데이터가 널리 퍼져있는 시대인 만큼 항상 이런 사이트를 들어가면 혼자 헤매는데, BRIC 글쓴이께서는 "데이터의 늪에 빠지지 않기 위해서는 질문 또는 목적이 명확해야 한다"고 말씀하셨습니다. 저도 그래봐야 겠습니다.

 

이제 최근에 읽고 있는 논문 1)에 등장한 용어를 정리해보겠습니다. 

 

 

1. EdU Labeling

 

 

EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)는 형광 분자와 결합력이 높으며, 세포 분열 중 DNA 복제 과정을 살피는데 활용될 수 있는 티미딘 유사체 2)입니다.

 

 

Cell proliferation 즉, DNA 복제 과정을 살필 수 있는 marker로 활용할 수 있는 BrdU를 소개한 적이 있죠? Brdu 또한 티민(T)과 유사한 화학구조를 가지는 물질로 T 대신 DNA 합성과정에 활용되기에 Brdu를 항원으로 주입한 후 anti-Brdu를 항체로 면역염색을 하면 cell proliferation rate을 확인할 수 있습니다 3).

 

[17일차] Signaling Entropy, Nanog, PAGA graph, 5-FU, Brdu, pHH3

 

 

그렇지만, BrdU를 검출하는 anti-BrdU 항체는 single stranded DNA에만 반응하기에(double-stranded DNA X), BrdU 검출을 위해선 denaturation을 해야한다는 한계가 있습니다 4). 문제는 denaturation 과정이 실험을 할 때 상당한 변동성(signficant varibaility)를 초래할 수 있다는 것입니다 5).

 

이에 반해 EdU는 항체를 이용하는 것이 아니기에 DNA denaturation이 필요하지 않고 그대신 클릭 화학 형광 검출 방법(chlick chemisty)을 사용하여 빠르게 검출할 수 있다고 합니다.

 

 

 

즉, 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)가 alternative thymidine analogue로 작용하여 alkyne group을 terminal methyl group으로 대체하는데, 이는 alkyne group에 fluorescent azide가 공유결합하도록 하여 click chemistry라는 반응을 통해 검출한다는 것입니다 4).

 

이러한 Edu labeling은 BrdU보다 독성이 적고 DNA 변성이 없다는 장점이 있지만 시약이 비싸다는 단점이 있습니다 5).

 

 

2. tdTomato

 

 

tdTomato는 이미지 분석을 위한 가장 밝은 적색형광단백질로, 트렌스제닉 마우스 모델의 Cre 재조합반응에 대한 리포터로써 이용합니다 6). 어떻게 리포터로써 활용될 수 있는지 설명해보려면, 우선 'Cre-loxp system'에 대해 정리해야 할 듯 합니다.

 

 

 

 

 

Cre-loxp 시스템은 두 DNA 인식 부위 사이에서 특이적 재조합을 촉매할 수 있는 'Cre 재조합 효소(Cre recombinase)'와  Cre 재조합 효소가 인식하는 회문 DNA 부위인 'Lox 부위'로 구성됩니다 7). 이러한 시스템을 활용하면 특정 시점에 특정 유전자를 knock out하거나 발현할 수 있습니다.

 

구체적으로, Cre 재조합효소가 인식하여 삭제할 수 있는 DNA 부위에 transcriptional stop signal을 배치하고(stop signal 앞뒤로 loxP 배치), 원하는 시기에 Cre 재조합효소를 활성화하여 stop signal을 삭제하여 유전자 발현을 유도할 수 있습니다.

 

 

위 영상 캡처, 출처 : Animated biology With arpan

 

 

이때 transcriptional stop signal 주변에 적색 형광 단백질을 만드는 tdTomato 유전자를 위치시키면, Cre 재조합 효소가 stop signal을 삭제했을 때 tdTomato 유전자가 발현이 되기에 전사 과정이 제대로 이루어지는지 확인할 수 있습니다 8). 

 

원하는 시점에 Cre 재조합효소를 활성화하기 위해 'Tamoxifen'을 사용합니다. Tamoxifen은 CreER 단백질과 결합하여 이를 활성화시키며, 활성화된 CreER 복합체는 핵으로 이동해 작용을 시작합니다. 이를 통해 특정 시점에서 Cre-loxP 재조합이 유도되며, 특정 유전자 구간을 제거함으로써 해당 유전자의 기능을 확인하거나 앞서 봤듯 stop signal을 제거함으로써 특정 유전자 발현을 유도할 수도 있습니다.

 

이때 Cre-loxP 시스템이 제대로 작동했는지는 reporter gene인 tdTomato의 발현 여부를 통해 확인할 수 있으며, tdTomato 단백질의 형광 발현이 이를 시각적으로 보여줍니다.

 

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우선 읽고 있는 논문에 등장하는 배경지식 두 가지를 정리해보았는데요, 더 읽기 전에 첫부분에 소개한 BRIC 글을 한번 따라해보는 시간을 가져보려고 합니다. 그래서 짧게 정리해보았습니다. 그럼 또 정리할 부분이 있으면 찾아오도록 하겠습니다. 감사합니다!

 

 

 

참고자료

 

1) Kyung, D.S., Lee, E., Chae, S. et al. (2024) Single-cell transcriptomic analysis reveals dynamic activation of cellular signaling pathways regulating beige adipogenesis. Exp Mol Med 56, 2309–2322

 

2) 신인희, "티미딘 유사체 EdU, 항암제 개발 가능성 확인", 2022년 8월 25일 기사, 후생신보, URL : https://www.whosaeng.com/138353

 

3) What is BrdU? - chemical structure and use in cell proliferation assays, BIO-RAD, URL : https://www.bio-rad-antibodies.com/brdu-bromodeoxyuridine.html

 

4) sigmaaldrich, EdU Cell Proliferation Assay, URL : https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/prod uct/documents/100/843/17-1052x.pdf

 

5) sigmaaldrich, 세포 생존성 및 증식 분석법, URL : https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/imaging-analysis-and-live-cell-imaging/cell-viability-and-proliferation?gad_source= 1&gclid=Cj0KCQiA6Ou5BhCrARIsAPoTxrBkZcRzGSspOqhFDyJJZ-jvr2cZclC2-Qowq7HIwv718nSiO2bYEEQaArWqEALw_wcB

 

6) 다카라코리아바이오메디칼, tdTomato-가장 밝은 적색형광단백질, URL : https://cms.takara.co.kr/file/lsnb/44_34-35.pdf

 

7) cyagen, Cre-lox System 소개, 2020, URL : https://korea.cyagen.com/community/technical-bulletin/cre-lox-system.html