안녕하세요, 이번 글에서는 장내미생물이 패혈증에 미치는 causal effects에 대해 분석한 논문을 정리해보도록하겠습니다.
Causal effects of gut microbiota on sepsis and sepsis-related death: insights from genome-wide Mendelian randomization, single-c
Background Gut microbiota alterations have been implicated in sepsis and related infectious diseases, but the causal relationship and underlying mechanisms remain unclear. Methods We evaluated the association between gut microbiota composition and sepsis u
translational-medicine.biomedcentral.com
저번에도 잠깐 보긴 했는데 이번에 연구 결과까지 읽어본 만큼 다시 적어보도록 하겠습니다. 논문 제목은 "Causal effects of gut microbiota on sepsis and sepsis-related death: insights from genome-wide Mendelian randomization, single-cell RNA, bulk RNA sequencing, and network pharmacology"로 2024년 Translational Medicine 저널에 개재되었습니다.
우선 연구배경부터 소개하겠습니다. 본 연구에서 다룬 패혈증(sepsis)은 전 세계적으로 발병률과 사망률 증가 추세를 보이는 감염성 질환인데요. 종종 중증 염증 반응과 multiple organ dysfunction syndrome (MODS)를 수반한다고 알려져 있습니다. 물론 조기 항생제 도입과 같은 sepsis 치료 전략에 발전이 있었긴 하지만, 아직 사망률이 높고 치료 성과는 여전히 최적이 아니라고 합니다. 따라서 sepsis의 병리학적 메커니즘에 대한 깊은 이해를 통한 새로운 치료 접근들을 찾는 것이 필수적인 상황입니다.
지난 연구들에서 sepsis의 progression에 있어 장내 미생물 불균형이 연관되어 있다고 보고되어왔는데요. 장내 미생물 구성의 균형이 무너지게 되면, pathogen과 toxin들이 intestinal barrier의 integrity를 망가뜨리고 순환계에 침투함으로써 면역 염증 반응이 발생하게 될 수 있기 때문입니다.
이러한 면역 염증 반응이 sepsis의 발생 및 progression에 있어 주요 요인일 수 있는 만큼 여러 연구들은 gut microbiota와 sepsis 사이의 연관성을 확인해왔습니다. 그러나 아직, 장내 미생물이 조절하는 면역 반응과 염증 반응을 고려한 gut microbiota와 sepsis 사이의 관계에 대한 연구는 불충분한 상황이라고 합니다. 이에 본 연구에서는 gut microbiota와 sepsis 사이의 관계가 있는지 파악함과 더불어 sepsis와 연관된 gut microbiota가 sepsis의 발병기전에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 그 기저의 메커니즘을 유전자 발현 패턴 분석을 통해 파악하고자 했습니다.
실험 디자인을 잠깐 소개하겠습니다. 본 연구팀은 먼저 Mendelian randomization (MR) study design을 적용하여 gut microbiota(GM)와 연관된 유전적 도구인 숙주의 SNP와 sepsis와 연관된 숙주의 SNP 사이의 causal relationship을 평가했고, sensitivity analysis를 통해 본 결과에 대한 추가적인 유효성 검증을 진행했습니다. 다음으로 eQTL analysis를 통해 MR 분석에서 sepsis 및 sepsis related infection에 positive 혹은 negative causal effect를 가할 수 있다고 밝혀진장내미생물과 연관된 숙주의 SNP를 관련 유전자에 매핑하였습니다.
이후엔 single-cell transcriptomics와 bulk RNA sequencing 기술을 활용해 개별세포별, 그리고 조건별로 높게 발현하는 유전자와 해당 유전자의 기능을 파악하였는데요. 추가적으로, 분자도킹 분석을 통해 앞서 밝혀낸 유전자들 중 sepsis protective GM과 연관된 SNP로부터 매핑된 유전자의 발현을 높이거나, 반대로 sepsis harmful GM과 연관된 SNP로부터 매핑된 유전자의 발현을 낮출 수 있는 약물들을 확인하였습니다. 종합적으로, 본 연구에서는 gut microbiota와 sepsis 사이의 관계의 보다 정확한 평가, 그리고 그 기저의 메커니즘을 밝힘으로써 sepsis의 맞춤형 치료를 위한 새로운 단서와 전략을 제공하고자 했다고 합니다.
그렇다면 sepsis에 causal effect를 가할 수 있는 장내미생물과 연관된 SNP로부터 매핑된 유전자가 어떤 생물학적 의미를 가지기에 세포유형별 / 조건별 유전자 발현 수준, 해당 유전자의 기능, 그리고 그 유전자의 발현을 조절할 수 있는 약물을 파악하고자 하는지 궁금해질 것 같습니다. 즉, 해당 유전자가 도대체 무엇을 의미하는 유전자이 길래 그 유전자를 대상으로 분석을 진행하는지 의문이 생길 듯합니다. 잠깐 설명하고 넘어가자면, 우선 장내 미생물 구성은 장내 환경 조성으로부터 영향을 받습니다. 즉, 특정 장내 환경 조성은 어떤 장내 미생물 구성에겐 유리하게 작용하고, 다른 장내 미생물 구성에겐 불리하게 작용할 수 있다는 것이죠. 그럼 어떤 장내 환경이 장내 미생물 구성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 설명해보도록 하겠습니다.
첫째, 장 상피세포 기능 및 장벽 투과도 조절을 통해 장내 미생물 구성을 변화시킬 수 있습니다(Regulation of intestinal barrier). 구체적으로, 숙주 유전자 발현 중 장 상피조직의 재생, 점액 분비, tight junction 단백질 조절 등에 관여하는 유전자의 발현을 조절하면 상피의 투과도나 점막 방어 기능이 달라지면서 특정 미생물 분류군이 더 잘 정착하거나 침투를 억제받아 결과적으로 군집 비율이 달라질 수 있습니다.
둘째, 장 점막 면역계의 변화를 유도함으로써 장내 미생물 구성을 변화시킬 수 있습니다(Alteration of mucosal immunity). 즉, 유전자 발현 조절을 통해 앞서 장 점막 방어벽 조절은 물론, 사이토카인 분비, 항균 펩타이드 생성 등에 변화를 일으켜서 특정 균주는 정착이 쉽고 특정 균주는 자라기 불리하게 유도할 수 있습니다.
셋째, 대사산물 및 영양 환경의 변화를 통해 가능합니다(Changes in metabolic products and nutrient environments). 장내 미생물과 숙주는 대사산물을 주고받으며 공생합니다. 그만큼 유전자 발현 조절을 통해 당 대사, 지질 대사, 답즙산 합성 및 재순환 등이 바뀌면 그에 맞춰 장내 영양소 농도나 담즙산 조성, pH, 산화 환원 상태 등이 달라지고 이러한 대사적, 화학적 미세 환경 변화는 특정 균주에게 유리하게 혹은 불리하게 작용할 수 있습니다.
넷째, 마지막으로, 면역세포의 분화 및 활성에 따른 2차적 효과는 장내 미생물 구성에 영향을 미칠 수 있습니다. 장내 미생물은 숙주의 면역계와 상호작용한다고 알려져 있는데요. 그만큼 면역 반응이 바뀌면 미생물 총과 숙주 사이의 상호작용, 예를 들어 균주 특이 면역반응과 염증성 사이토카인 분비 등이 달라지며 결과적으로 미생물 군집에 압력이 가해질 수 있습니다.
지금까지 장내 환경 조성이 장내 미생물 구성에 영향을 미칠 수 있는 부분들에 대해 적어보았는데요. 장내 미생물 구성 또한 장내 환경 변화에 영향을 미칠 수 있습니다. 예로, 특정 장내 미생물이 분비한 대사산물, 장내 미생물에 의한 장 상피세포와 면역세포의 기능 변화 등이 장내 환경을 변화시킬 수 있죠. 본 연구팀은 이렇듯 장내 미생물 구성이 장내 환경변화 및 인체 메커니즘에 영향을 끼쳐 sepsis 발달을 유도할 수 있다는 가정 하에, 장내 미생물의 sepsis에 대한 인과적 효과를 파악하고자 했습니다.
분석 기법으로 사용된 MR 분석에 대해 잠깐 소개하고 넘어가겠습니다. 여기서 MR 분석은 유전 변이를 도구 변수로 활용해 노출 변수가 결과 변수에 미치는 영향을 추론하는 방법입니다. 물론 두 변수 간의 인과적 관계를 추론하는 방법은 여러 방법이 있지만, MR 분석 방법은 두 변수 간의 관계에 있어 교란 변수로 인한 잘못된 해석을 최소화할 수 있다는 점에서 강점이 있다고 합니다(물론, MR 연구는 관계를 추론하는 통계적 기법이기에 단지 상관관계를 밝힐 뿐 인과성을 명백하게 설명할 순 없습니다). 이때, 교란 변수로 인한 잘못된 해석을 최소화할 수 있는 이유는 MR 분석의 주요 개념 중 '유전적 무작위성(genetic randomization)'과 연관이 있는데요. 본 개념은 “유전자는 부모로부터 무작위적으로 전달되기 때문에 이 유전변이가 노출과 결과에 미치는 영향은 일반적인 환경적 요인이나 생활 습관과는 별개로 작용할 가능성이 높다고 보는 것”입니다. 만약 유전자가 무작위적으로 전달되지 않는다면, 도구변수로서의 유전변이가 교란 변수로부터 독립적이지 않게 되어 인과관계 추론에 교란이 발생할 수 있습니다. 예를 들어서 설명해보겠습니다.
우선 특정 유전변이와 연관된 노출변수(X)가 특정 장내 미생물 구성이라고 가정해봅시다. 참고로, 유전변이와 장내 미생물 구성이 연관이 있다는 것은 그러한 장내 미생물 구성을 가진 사람들 대다수가 그러한 유전변이(ex. SNP)를 가지고 있었다는 뜻입니다. 즉, 통계적 분석 결과를 토대로 해당 유전 변이가 특정 장내 미생물 구성과 연관이 있다고 보는 것입니다. 그러려면 유전 변이가 장내 미생물 구성에 영향을 미칠 수 있다는 생물학적 지식 기반의 전제가 필요한데, 이에 대해선 앞서 말했듯 유전 변이에서 비롯된 장내 환경 조성이 장내 미생물 구성에 영향을 미칠 수 있기 때문이라고 볼 수 있겠습니다.
연구자 A가 특정 장내미생물 구성과 관련된 숙주의 유전변이들을 도구변수로 활용해 특정 장내 미생물 구성을 가진 사람일수록 불면증 발병 위험이 높은지 확인해보았다고 가정해봅시다. 그 결과, 특정 미생물 구성을 가진 사람일수록 불면증 위험이 높다는 결과가 나타났습니다. 그런데 문제는 연구자 A가 속한 세계는 '유전자가 부모로부터 비무작위적으로 선택되는 세계'였습니다. 즉, 부모들은 자신의 높은 사회경제적 지위에서 비롯된 유전형들을 자식들에게 비무작위적으로 물려주는 세계였습니다. 쉽게 말해, 높은 사회경제적 지위를 가진 부모들은 유전자 교정을 통해 우월한 형질만 발현되도록 맞춤형 아기를 만들어내는 세계였죠.
이렇다면, 장내미생물 구성만이 불면증 위험을 높였다고 보기 어렵습니다. 유전변이를 도구변수로 했다고 하더라도, 해당 유전변이가 사회경제적지위와 상관관계가 있고, 사회경제적 지위가 장내미생물 구성 및 불면증과 연관이 있을 수 있기 때문입니다. 예로, 사회경제적지위가 높은 사람들은 유전자 조작을 통해 불면증이 나타나지 않도록 하였는데 낮은 사람들은 그러지 못해서 불면증 위험이 높은 것일 수 있습니다. 그러면서 그들은 사회경제적지위에 따라 먹는 음식이 다르기에, 그리고 장내 환경조성도 유전자 발현 조작으로 영향을 미쳤기에 장내미생물 구성도 달랐죠. 결국, 장내미생물 구성과 불면증 사이에서 사회경제적지위라는 너무 큰 교란 변수가 영향을 미치게 된 것입니다. 마치, ‘여름’이라는 교란 변수가 작용해 아이스크림 판매가 높아져서 열사병 위험이 높아지는 그런 느낌입니다.
그렇지만, 우리의 세계에선 부모의 유전자형은 무작위적으로 자식에게 전달됩니다. 아이가 엄마를 더 닮을지 아빠를 더 닮을지 우리는 조작할 수도, 그리고 낳기 전엔 예측할 수도 없습니다. 따라서 표본을 충분히 확보한다면 유전변이를 도구변수로 활용했을 때 유전변이는 사회경제적 지위와 같은 잠재적 교란 변수와 직접적인 관련 없이 분포하기에 노출 변수와 연관된 유전변이의 effect size와 결과 변수와 연관된 유전변이의 effect size 사이의 상관성을 교란 변수의 영향을 최소화하며 파악할 수 있습니다. 내용이 너무 길어지는데 그냥 글로 정리하는거니까 계속 이어가겠습니다.
MR 분석에는 세 가지 가정이 있습니다. 첫째, 도구변수인 '유전변이(genetic variants)'는 노출변수(exposure)와 강하게 연관되어 있어야 한다는 것입니다. 당연한 말이지만 만약, 유전 변이가 exposure와 연관되어 있지 않다면, 유전 변이를 도구 변수로 exposure와 outcome 간의 인과적 관계를 추론할 수 없겠죠.
둘째, 유전변이는 exposure와 outcome 사이를 연결한다고 관찰된 confounding factor, 즉, 교란 변수와 연관되어선 안 됩니다. 예로, 아이스크림을 많이 먹으면 열사병 위험이 높아진다는 그런 관계는 '여름'이라는 교란 요인이 작용한 것으로 볼 수 있습니다. 앞서 말했던 유전적 비무작위적인 세계에서 사회경제적 지위도 교란 요인으로 볼 수 있습니다. 셋째, 유전 변이는 오직 exposure를 통해서만 outcome에 영향을 주어야 합니다. 만약 MR 분석 결과 특정 장내 미생물 구성이 불면증에 인과적 영향을 미친다고 했을 때, 그 장내미생물 연관된 유전 변이가 또 다른 특성인 '알츠하머병'과도 연관이 있다면, 장내 미생물 구성이 아닌 알츠하이머병에 의해 결과 변수 불면증이 발생하는 것일 수도 있겠죠. 뒤에서도 살펴보겠지만, 이렇게 유전변이가 exposure가 아닌 다른 경로로 outcome에 영향을 미치는 특성을 horizontal pleiotropy라고 합니다.
이제 분석 방법 소개를 마치고, 연구 결과를 소개하도록 하겠습니다. 본 연구팀은 앞서 말했듯 gut microbiota가 sepsis에 인과적 효과를 발휘하는지 MR 분석을 통해 확인하였습니다. 분석 결과 IVW 방법 기준 sepsis에 영향을 미치는 11개의 taxonomic group들을 파악할 수 있었습니다. 그중 6개의 그룹은 오즈비 1 미만으로 abundance 증가가 패혈증 발생 위험 감소와 유의하게 연관되어 있었는데요. 참고로, 오즈비는 MR 분석 결과로 나온 각 SNP의 MR 추정치, 기울기를 지수함수를 취해 변환하며, 오즈비가 0.8이라면 노출이 1단위 증가할 때 결과가 1일 오즈가 0.8배가 된다라고 해석할 수 있습니다.
Causal effects of gut microbiota on sepsis and sepsis-related death: insights from genome-wide Mendelian randomization, single-c
Background Gut microbiota alterations have been implicated in sepsis and related infectious diseases, but the causal relationship and underlying mechanisms remain unclear. Methods We evaluated the association between gut microbiota composition and sepsis u
translational-medicine.biomedcentral.com
한 예시로 위의 figure 왼쪽 상단에 있는 미생물 그룹인 Lentisphaeria의 경우 오즈비가 0.859가 나왔기에 해당 미생물군의 풍부도가 1단위 증가할 때 패혈증 발생의 오즈(odds)가 0.85배 증가, 다시 말해 약 14% 감소한다고 해석할 수 있습니다. 그 옆에 적힌 95% 신뢰구간인 CI 값 0.781–0.944는, 표본 데이터로부터 추정된 결과에 근거하여 실제 모수 즉, 진짜 OR이 95%의 확률로 이 범위 내에 있을 것이라는 의미합니다. 결국 Lentisphaeria 분류군은 sepsis에 대해 protective한 효과를 가지는 미생물이라고 할 수 있겠습니다. 나머지 5개의 미생군은 오즈비 1 초과로 abundance 증가가 패혈증 발생 위험 증가와 유의하게 연관되어 있었으며, 이는 해당 미생물군이 패혈증에 대한 harmful effects를 가짐을 시사합니다.
본 연구팀은 이러한 MR 결과에 heterogeneity가 존재하는지, 즉, exposure와 outcome 사이의 관계에 이질성이 존재하는지 확인하고자 하였습니다. 이때, 일부 SNP의 효과 크기가 다른 SNP들과 유의하게 다르면 heterogeneity가 존재한다고 볼 수 있으며, SNP 간 추정치의 일관성을 검정하는 대표적인 방법으로 Cochran’s Q test가 있습니다.
위의 Cochran’s Q 공식을 보면, 여기서 베타j는 j번째 SNP가 추정하는 '노출이 결과에 미치는 효과'이고, wj는 j번째 SNP에 대한 분산이자 가중치, 베타IVW는 IVW 기법으로 통합한 전체 효과 추정치인데요. 결국 Q는 각 SNP의 효과 추정치가 IVW 통합 추정치와 얼마나 차이가 있는지를, 그 분산까지 가중치로 고려하여 합산하며, Q값이 클수록 SNP간 추정치가 IVW 평균으로 멀리 떨어져 있다, 즉 SNP 효과 추정치 간 이질성이 크다는 신호로 해석합니다. 물론, 이질성 여부는 Q값의 크기가 아닌 p값을 통해 결정하는데요. Q 값의 p값이 매우 작다면 SNP들이 동일한 인과효과를 공유한다는 귀무가설을 기각하며 "이질성이 통계적으로 유의하게 존재한다"라고 결론을 내릴 수 있다고 합니다. 본 연구에서 MR 결과에 대해 Cochran’s Q test를 진행한 결과에선 모두 p값 0.05 이상으로 microbial taxa들의 genetic IVs의 sepsis에 대한 효과의 이질성은 유의하게 나타나지 않았습니다.
참고로, 본 연구팀은 GWAS case를 하나의 sepsis case만을 대상으로 한 것이 아닌, sepsis, sepsis 28-day survival outcome, 그리고 sepsis related infection 세 가지 유형 총 5가지 case를 대상으로 했습니다. 그중 두 번째인 sepsis 28-day survival outcome case 결과변수로 MR 분석을 진행한 결과에선 5개의 미생군의 abundance 증가가 패혈증 발생 위험 감소와 유의하게 연관되어 있었습니다. 반면, 4개의 미생물 분류군들은 풍부도가 증가하면 패혈증 위험이 증가하는 negative harmful effect를 나타냈습니다. 이 또한, Cochran's Q test에서 각 microbial taxa의 genetic IVs는 heterogeneity를 유의하게 나타내지 않았다고 합니다. 이외에도 동일한 방식으로 MR분석을 통해 sepsis related-infection 세 가지 케이스에 대해 어떤 미생물군이 유의한 영향을 미치는지 해보았고, Cohran’s Q-test를 진행해 모든 케이스에서 관계의 이질성이 나타나지 않음을 확인했습니다.
다음으로 sepsis와 sepsis-related infections 모든 케이스, 5가지 케이스와 연관된 장내 미생물을 대상으로 MR-Egger 회귀분석을 진행했습니다. 위에서 말했듯 MR-Egger은 horizontal pleiotropy를 나타내는 절편항을 포함하고, 그 절편이 0과 유의하게 다르면 horizontal pleiotropy가 존재함을 의미하는데요. horizontal pleiotropy는 수평적 다면효과, 즉 도구변수인 SNP가 exposure가 아닌 다른 경로로 outcome에 영향을 미치는 효과라고 볼 수 있겠습니다. 그만큼 exposure와 outcome 사이의 유의한 인과적 관계를 볼 때 horizontal pleiotropy가 유의하게 나타나면 관계의 신뢰성이 떨어지겠죠. 결과적으로, MR 분석 결과 모든 5가지 케이스에서 절편 값이 0과 통계적으로 유의하게 차이가 없는, p값 0.05 초과의 결과가 나타났으며, 이는 본 결과에서 horizontal pleiotropy가 유의하게 나타나지 않았음을 암시합니다.
MR 분석에서 특정 도구 변수, 즉, 하나의 SNP가 통계적으로 너무 큰 영향을 끼친다면 전체적인 결과에 왜곡을 일으킬 가능성이 있습니다. 따라서 본 연구팀은 효과 추정치가 특정 유전변이에 의해 과도하게 좌우되는지 점검하기 위해 leave one out analysis를 통해 각각의 SNP를 하나씩 제외하면서 동일한 MR 분석을 반복해 결과값 즉, 인과추정치가 어떻게 변하는지 시각화를 통해 확인해보았습니다. 그 결과 보시다시피 SNP 간 특이적인 MR effect의 차이가 없어 outlier에 따른 결과 편향의 문제도 없음을 확인했습니다. 추가로 sepsis가 장내미생물 구성에 causal effect를 가하는지 확인하는 reverse MR analysis를 수행한 결과, 둘 간의 causal relationship이 나타나지 않았다고 합니다.
SNP Annotation Tool
Your query has been submitted for an initial genomic mapping and preprocessing. This may take a few seconds up to some minutes depending on the number of variants in your query. Please wait until the windows refreshes itself. Alternatively, you can save th
www.snp-nexus.org
이후 본 연구팀은 SNPnexus라는 web-based variant annotation tool을 활용해서 5가지 분류의 sepsis 각각에 유의한 causal effect를 나타낸 장내 미생물 구성과 연관된 숙주의 SNP로부터 매핑되는 숙주 유전자를 파악했습니다. 앞서 말했듯 이 유전자가 장내 환경 조성을 변화시켜 장내 미생물 구성 변화에 영향을 미칠 수 있는데요. 그 기전을 파악함으로써 sepsis에 대한 보호적 효과를 일으키는 장내 미생물 구성과 연관된 유전자가 관여하는 생물학적 경로의 활성은 높이고, sepsis에 대한 해로운 효과를 일으키는 장내 미생물 구성과 연관된 유전자가 관여하는 생물학 경로의 활성은 억제하는 전략을 수립할 수 있을 것입니다. 이를 위해선 먼저 각 유전자가 어떤 기능을 하는지 먼저 이해해봐야겠죠.
본 연구팀은 그렇게 장내 미생물과 연관된 질병 관련 유전자를 가지고 gene ontology analysis, GO analysis를 진행하여 장내 미생물과 밀접하게 연관된 질병 관련 유전자들이 어떤 생물학적 과정, 세포 구조, 분자 기능에 주로 속하는지를 확인하였습니다. 그 결과 protective gut microbiota와 연관된 유전자 세트에서는 Glutamate and lipid metabolic pathway 등의 경로가 풍부하게 나타났는데요. 이는 숙주의 글루탐산과 지질 대사 경로에 해당 미생물군들이 직간접적인 영향을 가하거나, 반대로 해당 경로로부터 해당 미생물군이 영향을 받을 수 있음을 시사합니다. 구체적으로, 해당 경로를 통한 장내 영양 및 면역 환경이 미생물이 이용할 수 있는 영양소나 대사산물에 영향을 주어 해당 미생물종이 더 잘 자라게 할 수도 있을 것이고, 반대로 미생물이 글루탐산을 분해 및 대사하여 짧은 사슬 지방산, SCFA 등의 이로운 물질을 만들어 내며 숙주의 글루탐산 대사 경로에 영향을 미칠 수도 있는 것이겠죠. 장내 미생물 구성이 sepsis에 미치는 영향은 단일방향으로 나타났지만, 장내 미생물 구성과 그와 연관된 SNP로부터 매핑된 유전자가 관여하는 생물학적 경로와의 관계는 양방향일 수 있으니까요.
반면, harmful gut microbiota의 경우엔 “B cell differentiation”, “myeloid leukocyte cytokine production”, “Fc receptor signaling pathway”, histone deacetylase activity (H3-K14 specific) 등의 경로가 풍부하게 나타났는데요. 이것은 이와 같은 경로가 sepsis에 causal effect를 가하는 해로운 미생물군에게 유리하게 작용하거나, 해로운 미생물군이 이와 같은 경로에 직간접적인 영향을 줄 수 있음을 시사합니다. 참고로, KEGG pathway enrichment analysis의 결과에서는 유의한 enrichment pathway가 나타나지 않았다고 합니다. 자세하고 정확한 부분은 논문을 참고하시길 바랍니다.
다음으로 본 연구팀은 scRNA-seq 데이터 분석을 통해 패혈증 환자에게서 어떤 면역세포 유형에서 어떤 유전자가 특이적으로 높게 혹은 낮게 발현되는지 확인했습니다. 즉, 앞선 MR 분석에서는 sepsis에 영향을 미치는 장내 미생물 분류군들과 연관된 숙주의 SNP로부터 매핑되는 숙주 유전자들을 확인했다면 이번에는 해당 숙주 유전자들이 sepsis 조건에서 등장하는 면역세포들에서 어떤 발현 양상을 보이는지 확인하고자 하는 것입니다. 이를 위해 본 연구팀은 healthy control 2명, 그리고 그람 음성균에 의한 패혈증 생존자 6명, 사망자 4명 총 12명의 사람으로부터 PBMC 데이터를 얻었습니다. 참고로, sepsis에서는 그람 양성균과 그람 음성균 모두 주요 역할을 할 수 있다고 합니다.
이후 본 연구팀은 다음과 같은 조건의 케이스로부터 수집된 scRNA-seq 데이터에 대하여 전처리, 차원축소, 클러스터링, 그리고 cell-type annoation 과정을 통해 총 14개의 subcluster를 파악하였고, 그중 주요 세포 유형은 9개의 세포유형(B cell, Monocyte, T_cells, NK_cell, Neutrophils, Pre-B cell_CD34-, Platelets, GMP)으로 나타났다고 합니다.
그렇게 본 연구팀은 SNP로부터 매핑한 장내미생물과 연관된 sepsis 관련 유전자가 각 면역 세포유형별로 어떤 발현 양상을 보이는지 확인했습니다. 이는 장내 미생물 풍부도와 통계적으로 유의미하게 연관관계를 보이는 숙주의 SNP로부터 매핑된 유전자 중 어떤 유전자가 특정 면역세포에서 높게 발현하고, 그 기능은 무엇인지 파악하기 위함으로 볼 수 있겠습니다. 다시 말해서, 앞서 설명했듯 해당 유전자 발현이 면역세포의 분화 및 활성에 영향을 미치고, 그것이 면역계와 장내미생물 상호작용 양상을 암시해(장내미생물 -> 면역계) 그로 인한 sepsis 발달이 나타나게 되는지 그 메커니즘을 규명하기 위한 목적이라고 볼 수 있겠습니다.
그렇게 본 연구팀은 각각의 면역세포 유형에서의 앞서 매핑한 유전자들의 발현 패턴을 비교해보았습니다. 먼저 sepsis 케이스에 causal effect를 가하는 장내미생물과 연관된 SNP로부터 매핑된 유전자들의 발현 패턴을 scRNA-seq 데이터의 healthy 조건과 sepsis 조건을 구분하여 비교해보았습니다. 그 결과, 'PLCG2'라는 유전자가 healthy 조건에 비해 sepsis 조건에서의 면역세포들에서 유의하게 upregulate되어 나타났습니다. 결론부터 말하자면 PLCG2의 경우, 염증 신호 연쇄 반응과 면역 세포 활성 조절에 주요 역할을 한다고 알려져 있다고 합니다. 특히, PLCG2의 비정상적인 활성과 해당 유전자에서의 돌연변이는 자가염증질환과 자가면역질환과 같은 특정 염증 장애와 연결되어있다고 알려져 있습니다.
또한, 'BCL6'는 sepsis 조건에서의 Pre-B cells (CD34−)에서 유의하게 up-regulate되어 나타났습니다. 해당 유전자는 transcriptional repressor를 발현하며, B cell 발달 및 기능에 주요 역할을 한다고 알려져 있습니다. 물론, BCL6가 inflammation과 sepsis을 직접적으로 암시하지는 않지만, 해당 유전자는 면역반응 조절에 주요 역할을 하고, pro-inflammatory와 anti-inflammatory signaling pathways 사이의 균형에 영향을 줄 수 있다고 합니다.
다음으로 28-day survival outcomes for sepsis를 대상으로 유전자 발현 패턴을 확인해보았는데요. 흥미롭게도 장내미생물과 연관된 ZDHHC19 유전자가 healthy individuals의 platelets에서는 아주 낮은 발현을 가진 반면, 28일 기준 생존한 sepsis 환자의 platelets에선 증가된 발현, 사망한 sepsis 환자의 platelets에게선 가장 높은 발현이 나타났다고 합니다. 본 결과로부터 연구팀은 septic platelets에서의 증가된 ZDHHC19 발현이 inflammatory severity 및 clinical outcomes와 상관관계가 있을 수 있음을 보여준다는 가설을 제안하였습니다. 특히, sepsis는 면역억제 환경(immunosuppressive milieu)을 유도하고, ZDHHC19 발현은 면역 억제 및 염증성 면역에 관여한다고 알려진 TGF-β pathway를 활성화할 수 있다고 밝혀졌는데요. 이러한 관점에서 sepsis platelets에서의 증가된 ZDHHC19 발현은 sepsis에서의 면역 마비(immune-paralysis)와 면역 노화(immunosenescence) 기능과 연결될 수 있다고 논문 저자는 말합니다. 그만큼 다양한 임상적 맥락에서 sepsis platelet 기능에 있어 ZDHHC19의 메커니즘과 그것이 sepsis progression에 미치는 potential impact를 밝힐 필요가 있다고 하네요. 본 연구팀은 다른 GWAS 케이스들에 대해서도 조건별로 유전자 발현 패턴을 비교했으며, 자세하고 정확한 사항은 논문을 참고하시길 바랍니다.
다음으로 본 연구팀은 앞선 결과에 대한 교차 검증을 위해 Bulk RNA analysis를 진행했는데요. 구체적으로, limma를 활용하여 healthy individuals와 sepsis patients 사이의 differential gene expression analysis를 진행했습니다. 그 결과, single-cell analysis 결과에서 조건별로 낮게 혹은 높게 발현한 유전자들이 Bulk RNA analysis에서도 같은 양상으로 등장하였다고 합니다.
limma
Data analysis, linear models and differential expression for omics data.
bioconductor.org
마지막으로 본 연구팀은 AutoDock Vina 툴을 사용해서 Molecular docking analysis를 진행했습니다. 분자도킹분석에서는 유전자와 기존에 알려진 약물 간 상호작용을 분석하는데요. 구체적으로, 먼저 유전자로부터 발현되는 '표적 단백질', 그리고 약물 후보물질인 결합 화합물 '리간드'의 3차원 구조를 여러 데이터베이스 등에서의 조사를 통해 확보합니다. 참고로, 본 논문에서 저자는 PubChem database로부터 각 분자 리간드 drug의 2차원 구조를 확보한 후 Chem3D softaware에 적용해 3차 구조로 전환했습니다. 장내 미생물 구성과 연관된 SNP로부터 매핑된 유전자로부터 발현되는 표적 단백질의 경우엔, RCSB로부터 3차원 구조를 확보했다고 합니다.
AutoDock Vina
AutoDock Vina This site was built for the legacy version of AutoDock Vina, v1.1.2 (last revision: May 2011). It remains open for information purposes. Most of the methods and protocols for protein-ligand docking have been re-implemented with improvements i
vina.scripps.edu
이후엔 단백질 구조를 도킹에 적합하도록 최적화하는 과정인 protein preparation, 그리고 도킹에 사용할 약물 개발 잠재력이 있는 리간드 후보군을 선별하는 Lead/Hit identification을 진행한 뒤, 도킹 과정에서 어느 부위를 표적으로 할지 정합니다.
그렇게 후보 약물이 단백질의 결합 포켓 내에서 어떤 방향과 위치로 자리잡는지 예측하여 약물과 단백질 사이의 수소결합, 소수성 상호작용 등 비결합성 상호작용에 의해 생성되는 자유 에너지 변화를 계산합니다. 이때, 산출된 값이 더 음수일수록 열역학적으로 유리하여 결합복합체가 더 안정하게 형성될 가능성이 높다는 것을 의미한다고 합니다. 자세한 내용은 아래 다른 논문을 참고하시길 바랍니다.
Molecular docking as a tool for the discovery of molecular targets of nutraceuticals in diseases management - PubMed
Molecular docking is a computational technique that predicts the binding affinity of ligands to receptor proteins. Although it has potential uses in nutraceutical research, it has developed into a formidable tool for drug development. Bioactive substances
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
본 논문에서는 -5 kcal/mol 미만의 결합에너지는 effective ligand-receptor binding, -7 kcal/mol 미만의 결합 에너지는 strong binding activity로 정의하였습니다. 그렇게 분자 도킹 분석을 진행한 결과, 항암제의 일종인 Fluorouracil은 장내미생물과 연관된 sepsis 조건에서 up-regulate되어 나타나는 유전자인 NTSR1의 발현을 감소시킬 수 있음이 나타났습니다. 그 외에도 앞서 밝힌 질병 관련 유전자를 대상으로 sepsis 조건에서 up-regulate되는 특정 유전자의 발현을 감소시키는 특정 약물, sepsis 조건에서 down-regulate되는 특정 유전자의 발현을 증가시키는 특정 약물들을 밝혀냈습니다.
구체적으로, Dexamethasone, Doxorubicin, Gentamicins, 그리고 Resveratrol가 세 개 혹은 그 이상의 action targets를 보여주었는데요. 그중에서 Dexamethasone, Gentamicins, 그리고 Resveratrol가 sepsis 조건에서의 본 약물들의 역할 기인했을 때 유의한 적용 가능성을 보였다고 저자는 말합니다. 참고로, 덱사메타손(Dexamethasone)은 강한 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 그것의 항염증 및 면역조절 효과 기능으로 잘 알려져 있으며, 코로나19 치료에 적용이 되기도 하여 주목을 받았었죠.
Gentamicins는 넓은 범위의 antibacterial activity를 보이는 아미노글리코시드 항생제(세균의 30S 리보솜과 결합해 mRNA 염기배열의 오독을 유발2))이고, 마지막으로, Resveratrol는 포도주와 포도껍질에 있는 폴리페놀계 물질로, 그것이 가진 항산화 및 항염증 성질로 연구되어 왔다고 합니다.
앞서 봤듯 연구에서는 sepsis에 protective effects 혹은 harmful effects를 가할 수 있는 여러 종류의 gut microbial taxa를 파악할 수 있었는데요. 그 중 몇가지 장내 미생물을 소개해보겠습니다. 논문에 결론 내용이 워낙 길어서 그냥 공부 겸 곁가지 내용도 다 적어보겠습니다.
먼저 Coprococcus라는 미생물군은 sepsis 케이스는 물론, 28-day survival outcomes 케이스에서도 beneficial gut microbiota로 유의하게 나타났는데요. 여기서 Coprococcus는 뷰티르산(butyric acid)의 주요 생산자 중 하나로 장 건강은 물론, 면역억제 등 면역계 균형과 연관이 있는 beneficial microbial species라고 합니다. 이러한 관점에서 본 연구팀은 Coprococcus genus가 여러 면역세포들과 사이토카인, 케모카인 등의 분자들이 관여하는 과도한 면역 반응을 억제하는 기능에 관여하여 sepsis에 beneficial effects를 가할지 모른다는 가설을 본 결론에서 제시하였습니다. 앞서 말했듯 MR 분석을 통해 Coprococcus가 sepsis에 대한 protective causal effect를 가할 수 있음을 밝혔으니까요.
또한, 선행연구에서는 Coprococcus genus의 계통학적 분류인 Lachnospiraceae가 intestinal inflammation의 조절에 주요 역할을 할 수 있음을 밝혔습니다. 구체적으로, Lachnospiraceae family의 특정 멤버는 dietary fiber를 발효하여 butyrate와 같은 short-chain fatty acids를 생산함으로써 장 내 환경을 조절해 intestinal barrier function을 유지하고 inflammatory responses를 억제한다고 알려져 있습니다. 이는 본 미생물 군으로부터 생성되는 부티레이트(butyrate)가 intestinal epithelial cells를 위한 에너지 자원으로서 역할을 할 수 있음과 더불어 면역세포의 기능에 영향을 가할 수 있기 때문이죠. 결국, 특정 미생물군이 장내 환경 조성을 변화시키고, 그로부터 숙주의 질병 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다고 볼 수 있겠습니다.
추가로, Lachnospiraceae bacteria의 불균형이 가속화된 intestinal inflammation과 연관이 있을 수 있다고 하는데요. 본 연구에서는 Coprococcus genus 외에 Lachnospiraceae bacteria에 속하는 Lachnospiraceae UCG004 genus와 Lachnospiraceae FCS020 genus가 sepsis, 그리고 그것의 survival outcomes에 harmful effects를 가할 수 있음을 밝혔고, Lachnospiraceae ND3007는 protective effects를 가할 수 있음을 밝혔죠. 이는 해당 미생물 군 중 harmful genus의 비정상적인 증가 혹은 beneficial genus의 비정상적인 감소와 같은 장내 미생물 불균형이 sepsis 발생 및 발전에 기여할 수 있음을 시사합니다.
또 다른 미생물군인 Ruminococcus는 저항성 전분(resistant starch)의 소화 및 대사에 주요 역할을 하는 흔한 장내 미생물 속(genus)으로 알려져 있는데요, 그렇게 만들어진 glucose와 같은 산물들이 다른 미생물의 생장의 에너지원으로 사용될 수 있다고 합니다. 무엇보다 이 Ruminococcus는 여러 gastrointestinal diseases, immune-related disorders, 그리고 neurological disorders와 연관되어 있다고 알려져 있습니다. 구체적으로, 일부 연구에서는 이와 같은 질환들을 가진 환자의 장에서의 Ruminococcus의 quantity와 activity가 서로 다르고, 이는 장 건강과 염증의 정도에 영향을 미칠 수 있음을 밝혔습니다. 그렇지만, 구체적인 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았으며, 단지 일부에서 Ruminococcus가 intestinal immune system과 inflammatory responses의 조절에 영향을 미침으로써 면역 매개 질환의 pathogenesis, 그리고 장 뇌 연결축을 통해 neural function에 관여할 수 있음을 밝힌 상황입니다.
마지막으로 Bacteroides는 사람 장에서 사람과 공생관계를 맺는 흔한 세균 속으로, 장 건강과 기능을 유지하는데 결정적인 역할을 합니다. 그들은 음식에서의 복잡한 탄수화물의 분해를 도우면서 몸을 위한 필수 영양분과 에너지를 생산한다고 알려져 있죠. 그렇지만, 특정 케이스에선 Bacteroides는 sepsis를 유도하는 pathogens 중 하나일 수 있는데요. intestinal perforation(구멍뚫기), rupture(파열), dysbiosis, 그리고 compromised immune function(면역억제)는 Bacteriodes와 같은 장내 세균이 abdominal cavity 혹은 혈류로 들어가도록 하여 감염과 sepsis를 유발할 수 있다고 합니다. 이것도 장내 환경이 장내 미생물의 병리학적 효과를 촉진하는 예시로 볼 수 있습니다.
지금까지 여러 미생물 군이 관여하는 기능들을 소개하였는데, 사실 논문에 적혀있듯이 이러한 bacterial populations와 질병 간의 관계는 아직 충분히 조사되지 않은 상황입니다. 무엇보다 장내 미생물 구성의 복잡성과 inter-individual variation, 즉 사람 간의 변동성이 이러한 관계 분석을 어렵게 한다고 하네요. 장내미생물 구성은 유전적 요인은 물론, 식습관, 생활환경, 약물복용이력 등 개인별로 영향을 미치는 요소가 다양하기에 동일한 질병상태라도 미생물 군집 특성이 달라질 수 있기 때문이죠. 그리고 무엇보다 워낙 많은 장내 미생물이 우리 몸 안에서 거주하고 있으니까요. 따라서, sepsis와 같은 infection-related diseases에서의 gut bacteria의 역할을 이해하는 추가 연구가 potential therapeutic strategies 개발을 위해 필요하다고 논문 저자는 말합니다.
본 연구의 한계로는 첫째, 비록 MR 분석을 할 때 교란 변수의 영향을 완화했음에도 불구하고 본 결과에 영향을 줄 수 있는 다른 설명하지 못한 잠재적 요인들이 존재할 가능성이 있습니다. 앞서 말했듯 MR 연구는 단지 상관관계를 밝힌 뿐 인과성을 명백하게 성립할 수 없기 때문입니다. 둘째로, scRNA-seq과 bulK RNA 시퀀싱과 관련된 데이터 해석과 분석에 한계가 있었는데요. 구체적으로 noise를 다루는 것, cell type을 파악하고 annotate하는 것, 데이터를 정규화하는 것, differential analysis를 위한 적절한 통계적 방법을 적용하는 것에 있어서 어려움이 존재했다고 합니다. 따라서 single-cell analysis에서 유전자 발현의 정확한 해석을 위해 추가적인 validation과 confirmation이 필수적이라고 논문 저자는 말합니다.
세번째로는, Potential Therapeutic Target 예측의 한계입니다. 비록 본 연구팀은 Potential Therapeutic Target로서 특정 유전자들을 파악하고 분자도킹 연구들을 진행하긴 했음에도 불구하고, 이러한 결과들은 추가적인 연구와 검증이 필요한 preliminary predictions, 즉, 예비 예측 정도라고 합니다. 분자도킹 분석은 잠재적인 ligand-target interaction 예측을 보여줄 뿐, 본 약물의 실제 이용가능성과 효험은 추가적인 in vitro와 in vivo 실험을 통해 검증을 할 필요가 있기 때문입니다. 마지막으로, sample selection과 대표성과 관련한 한계인데요. 본 연구에서의 sepsis patients로부터 얻은 혈액 샘플에 대한 의존이 sample selection bias와 한계를 유도할 수 있다고 합니다. 혈액 샘플에만 초점을 두는 것은 샘플 사이즈의 한계 등으로 sepsis의 포괄적인 스펙트럼을 충분히 캡쳐하지 못할 수 있기 때문입니다.
다시 한번 논문 연구 디자인을 요약하자면, 본 연구에서는 Mendelian randomization study design을 적용하여 gut microbiota와 sepsis 간의 인과적 관계를 먼저 조사하였고, sepsis에 beneficial 혹은 harmful하게 causal effect를 가하는 장내미생물을 파악할 수 있었습니다. 이후 eQTL analysis를 진행하여 sepsis와 연관된 장내미생물 관련 SNP로부터 sepsis 관련 유전자를 매핑할 수 있었고, 해당 유전자들을 대상으로 GO & KEGG 분석으로 유전자와 연관된 기능을 확인하였습니다. 이와 더불어 본 연구팀은 sepsis patients로부터 얻은 혈액 샘플에 대해 single-cell transcriptomic sequencing 기술을 사용해 조건별, 그리고 서로 다른 세포 유형별로 해당 유전자들의 발현의 차이를 비교 분석하였습니다. 추가로, bulk RNA sequencing 데이터를 사용해서 조건에 따른 해당 유전자들의 발현 양상에 대해 추가 검증을 진행했습니다. 마지막으로, 분자도킹 방법을 통해 앞선 분석으로부터 밝혀낸 유전자들과 기존 약물들과의 상호작용을 분석하여 potential therapeutic target이 될 수 있는 일부 유전자들과 약물들을 예측하였습니다.
종합적으로, 본 결과는 sepsis에 causal effect를 가하는 장내미생물과 연관된 질병 관련 유전자의 기능 및 해당 유전자와 상호작용 가능성이 높은 약물을 파악함으로써 sepsis를 위한 개인맞춤형 치료 전략을 개발하는데 insights를 제공할 수 있었다고 논문 저자는 말합니다. 이것으로 여러 생물정보학 툴을 활용해 장내미생물의 sepsis와 sepsis와 연관된 사망에 대한 causal effects를 밝혀낸 논문에 대한 공부 겸 정리를 마치겠습니다. 다음에 또 다른 정리해보고 싶은 게 생기면 정리해보겠습니다. 감사합니다!
참고자료
1) Yang, S., Guo, J., Kong, Z. et al. Causal effects of gut microbiota on sepsis and sepsis-related death: insights from genome-wide Mendelian randomization, single-cell RNA, bulk RNA sequencing, and network pharmacology. J Transl Med 22, 10 (2024).
2) 주혜성 기자, 토브라마이신과 과민반응, 약사공론, 2020, URL : https://www.kpanews.co.kr/academy/show.asp?page=102&idx=440
